低氧環(huán)境對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的增殖及LDH和Nodal表達(dá)的影響.pdf

1、目的:黑色素瘤（malignant melonoma,MM)是目前發(fā)病率上升最快、預(yù)后最為不良的惡性腫瘤之一，病死率居高不下。而決定其MM細(xì)胞代謝及增殖能力的機(jī)制仍不明，但可能與遺傳、創(chuàng)傷、免疫和病毒感染有關(guān)。目前認(rèn)為局部低氧是實(shí)體惡性腫瘤增殖過程中存在的普遍現(xiàn)象，低氧作為潛在信號(hào)可引起低氧相關(guān)基因及蛋白產(chǎn)生，使細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境。而高糖酵解是惡性腫瘤細(xì)胞的代謝特征之一，干預(yù)腫瘤細(xì)胞代謝將影響 MM的惡性程度。MM發(fā)生增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的

2、原因和機(jī)制是什么？什么是調(diào)控 MM進(jìn)程的關(guān)鍵點(diǎn)？隨著研究的深入，低氧條件下腫瘤糖酵解途徑的異常激活及Nodal分子促進(jìn)腫瘤發(fā)生作用受到關(guān)注。本課題擬使用氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)的MM細(xì)胞株A375細(xì)胞低氧，構(gòu)建MM細(xì)胞低氧模型，以LDH介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖作用為切入點(diǎn)，在細(xì)胞水平探討 Nodal（ Nodal growth differentiation factor）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）同工

3、酶亞基(LDH-A、LDH-B)蛋白的表達(dá)及 LDH同工酶譜變化，結(jié)果可對(duì) MM的靶向治療提供理論依據(jù)。方法：培養(yǎng)MM時(shí)加入含不同濃度化學(xué)低氧誘導(dǎo)劑 CoCl2的培養(yǎng)液（50、100、150、200、250、300、400uM），作用不同時(shí)間（12、24、48、72h），并設(shè)立對(duì)照組（CoCl2濃度為0uM），然后通過MTT法觀察低氧對(duì)MM細(xì)胞增殖能力的影響，以確立CoCl2誘導(dǎo)MM細(xì)胞增殖的適宜濃度和時(shí)間。采用 Western Blo

4、t技術(shù)檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factor，HIF-1a）蛋白表達(dá)水平以確定造模是否成功。Western Blot技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)低氧對(duì)MM細(xì)胞LDH-A、LDH-B、Nodal蛋白的表達(dá)及LDH同工酶譜活性的影響。結(jié)果：MTT法顯示CoCl2誘導(dǎo)的低氧對(duì)MM細(xì)胞的增殖能力隨著CoCl2作用濃度的遞增和作用時(shí)間的延長(zhǎng)其增殖活性逐漸下降。其中，CoCl2的作用濃度50、100、150、200、25

5、0uM時(shí)細(xì)胞增殖無明顯抑制（P>0.05）。從300uM開始就表現(xiàn)出明顯抑制作用。當(dāng)CoCl2的作用濃度為50、100、150uM，細(xì)胞在48h增殖達(dá)高峰（P<0.05）。Western Blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示CoCl2可上調(diào)MMA375細(xì)胞 HIF1-a、LDH-A、Nodal蛋白的表達(dá)，下調(diào)LDH-B蛋白表達(dá)（P<0.05），并呈現(xiàn)出一定的濃度及時(shí)間范圍依賴性關(guān)系；瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示隨著缺氧濃度的遞增，LDH同工酶譜變