雞、鴨和犬α干擾素全基因合成、原核表達及抗病毒活性測定.pdf

1、干擾素（IFN）是在特定的誘生劑作用下由細胞產生的一組具有抗病毒、抗腫瘤、參與免疫調節(jié)等多種生物學活性的糖蛋白，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三大類型。其中，Ⅰ型干擾素的抗病毒作用最強，對人類和動物病毒病的免疫防治等相關基礎性研究具有重要意義，具有廣闊的臨床應用前景.基因工程干擾素不僅與天然干擾素有高度相似的生物學活性，并且與傳統(tǒng)誘導淋巴細胞產生干擾素相比，還有純度高、適合規(guī)?；a、產品質量容易控制、產品質量穩(wěn)定等優(yōu)點，更重要的是通過大規(guī)模生產的基因

2、工程干擾素的成本大大降低，利于其在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用。本研究的目的就是利用基因工程技術和蛋白質工程技術研制出重組雞、鴨和犬α干擾素并研究其抗病毒功能，為其產業(yè)化生產及臨床應用奠定基礎。
　　 根據GeneBank上登錄的雞、鴨和犬α干擾素基因序列，去掉信號肽，保留編碼成熟蛋白的序列，按照大腸桿菌密碼子的偏好性及密碼子的兼并性，在不改變氨基酸組成和排列順序的基礎上，對已知的基因序列進行改造，全部替換為大腸桿菌喜好的密碼子，得到新

3、的編碼雞、鴨和犬α干擾素的基因序列，大小分別為489bp、486bp、495bp，并在序列兩端分別加上EcoRI、XhoI酶切位點，送生物公司進行全基因合成，并連入原核表達質粒pET32a中，得到pET32a-ChIFN-α、pET32a-DuIFN-α和pET32a-CaIFN-α三個重組原核表達質粒，經熱轉化入大腸桿菌BL21（DE3）中，加IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE電泳顯示，三個重組原核表達質粒均在大腸桿菌BL21（D

4、E3）中進行了高水平表達，得到三個相對分子質量均約為32kD的干擾素融合蛋白，并以包涵體形式存在。經細胞破碎、包涵體提取、洗滌、溶解變性及透析復性后得到較純的重組雞、鴨和犬α干擾素.
　　 利用微量細胞病變抑制法測定重組融合蛋白的抗病毒活性，結果如下：（1）利用雞胚成纖維細胞測定，重組雞α干擾素抗VSV活性為5.6x104U/mL，蛋白濃度為0.53mg/mL，比活性為1.06x105U/mg；抗NDV活性為1.35x105U/

5、mL，比活性為2.55x105U/mg。（2）利用鴨胚成纖維細胞測定，重組鴨α干擾素抗VSV活性為5.13×103U/mL，蛋白濃度為0.92 mg/mL，比活性為5.6x103U/mg。（3）利用MDCK細胞測定，重組犬α干擾素抗VSV活性為1.06x107U/mL，蛋白濃度為0.79 mg/mL，比活性為1.67x107 U/mg。
　　 對試驗雞進行新城疫人工感染的干擾素預防和治療試驗，試驗雞分成4組，1、2組分別于攻毒前