重組雞α干擾素結構與功能及其抗病毒活性的研究.pdf

1、中國是最大的養(yǎng)禽國，然而病毒病的流行一直困擾著養(yǎng)禽業(yè)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前一些禽類病毒性疾病仍然缺乏有效的治療手段，化學藥物的使用易造成耐藥性，且容易引起動物體內藥物殘留而影響人類健康，疫苗的研制則須考慮病毒變異和多樣性。因此，急需研制出安全、高效、新型的抗病毒制劑和免疫增強劑用于增強雞體的抵抗力和提高現(xiàn)有疫苗的保護率。干擾素是一類動物機體產(chǎn)生的多功能蛋白，它可由病毒感染而自發(fā)產(chǎn)生并隨血液循環(huán)至全身，激活細胞內抗病毒作用機

2、制合成各種抗病毒蛋白以抵抗病毒的侵擾。由于它高效的廣譜抗病毒活性和免疫調節(jié)活性以及其無可替代的臨床應用價值，從人類發(fā)現(xiàn)干擾素開始，就從未停止過對它的探索研究。近年來，各種動物干擾素的研究取得了突破性進展，在體外干擾素既可以單獨應用于疾病的防治，又可以與疫苗聯(lián)合應用，增強和改善疫苗的免疫效果，尤其是α干擾素在抗病毒感染等方面顯出良好的效果。近年來，雞干擾素（chicken interferon，ChIFN）的抗病毒和疫苗佐劑功能也在更多的

3、試驗中被發(fā)現(xiàn)和證實。本研究的目的就是應用基因工程和蛋白質工程技術研制出具有自主知識產(chǎn)權的重組雞α干擾素并研究其抗病毒功能和對疫苗的免疫增強作用，為我國重組雞干擾素的工程化生產(chǎn)及其在養(yǎng)雞業(yè)中的應用奠定基礎。研究主要從以下幾個方面展開：
　　 1、雞α干擾素是一個多基因家族，具有20多種亞型，不同亞型間的生物學活性也有差異。利用DNAStar分子生物學軟件，對不同品種雞α干擾素不同亞型的基因序列進行比較分析，篩選出同源性較高的基因序

4、列，并根據(jù)畢赤酵母的偏嗜性，換用畢赤酵母的優(yōu)勢密碼子，改變其成熟蛋白基因堿基序列，設計出一條新的雞α干擾素堿基序列，共507bp，利用primerpremier5.0分子生物學軟件，將該堿基序列設計成14條基因片段，相鄰兩條引物之間相互重疊15-22bp，SOE方法拼接該目的基因，將拼接好的該基因序列，連接到酵母表達載體pPICZα-A，構建表達載體為pPICZα-A-ChIFN-α。pPICZα-A-ChIFN-α經(jīng)SacⅠ酶切線性化

5、后電轉化導入畢赤酵母菌株X-33。轉化子經(jīng)PCR分析鑒定后利用甘油增菌和甲醇誘導。SDS-PAGE蛋白電泳顯示，pPICZα-A-ChIFN-α在畢赤酵母系統(tǒng)中進行了分泌表達，蛋白含量約為0.143mg·mL-1。經(jīng)VSV-CEF活性測定系統(tǒng)，測定其抗病毒活性約為1.76×106U·mL-1，比活性為1.23×107U·mg-1。本實驗實現(xiàn)了非天然干擾素在畢赤酵母中的成功表達，并具有較高的表達量和抗病毒活性。
　　 2、在人類干

6、擾素，利用點突變成功研究了個別氨基酸的改變引起其生物學功能發(fā)生變化，以此來研究出干擾素的基因結構與其功能的相互關系，在此基礎上，我們通過對比雞、人干擾素的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其C端有較高的同源性。依據(jù)人類IFN-α點突變方式，我們對雞的IFN-α進行了點突變，設計了五個突變體，分別為突變體Mut1：V141I，R142S，A145Y；突變體Mut2：V141L，R142S，A145Y；突變體Mut3：W138H，V141I，R142S，，A

7、145Y，W148S，L150S；突變體Mut4：L114S；突變體Mut5：L114S，W138H，V141I，R142S，A145Y，W148S，L150S；每個突變體分別設計14條基因片段，利用SOE拼接擴增而成，構建酵母表達系統(tǒng)并進行了成功表達，蛋白量在表達水平上沒有顯著差異。用VSV-CEF系統(tǒng)測定其活性，與未經(jīng)改造的干擾素進行比較：五個突變體活性差異較大，其中突變體Mut1和突變體Mut2活性較高，較未突變的干擾素活性分別提

8、高了28倍和15倍；突變體Mut4活性和原來相近；突變體Mut3和突變體Mut5活性較低，較未突變干擾素相比分別下降了32倍和23倍。結合已證實和預測的結構進行分析，發(fā)現(xiàn)：雞Ⅰ型α干擾素的受體結合部位位于第29-35位點氨基酸及第123-140位點氨基酸，IFN的C端對抗病毒、抗增殖活性有影響，氨基酸的突變有利于增強其組織親和力，提高其生物學活性。
　　 3、在雞胚成纖維細胞上研究了重組雞α干擾素對禽流感病毒（AⅣ）、新城疫病毒

9、（NDV）的抗病毒效果，結果表明：重組雞α干擾素可降低AⅣ在雞胚成纖維細胞上的增殖滴度，1000U/mL和100U/mL的重組α雞干擾素處理的雞胚成纖維細胞中AⅣ的滴度分別比對照降低2.76Log10TCID50和1.93Log10TCID50，高濃度的干擾素抑制作用更顯著；重組雞α干擾素對NDV在雞胚成纖維細胞中的抑制作用更為明顯，1000U/mL和100U/mL的重組α雞干擾素處理的雞胚成纖維細胞中強毒株的滴度分別比對照降低1.73

10、Log10TCID50和0.89Log10TCID50，1000U/mL的重組雞α干擾素可以完全抑制100TCID50/mL新城疫病毒在雞胚成纖維細胞上產(chǎn)生病變。
　　 4、使用重組雞α干擾素蛋白作為免疫佐劑，檢測雞α干擾素蛋白對禽流感病毒H9N2亞型滅活疫苗的免疫調節(jié)作用。將20日齡的海蘭白蛋雞，隨機分為6組，采用胸部肌肉注射方式進行免疫，對照組僅接種H9N2亞型禽流感滅活疫苗，試驗組分別同時接種H9N2亞型禽流感滅活疫苗0.