雞α干擾素的克隆、原核表達及其抗病毒效果研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、干擾素是一類動物機體產(chǎn)生的多功能蛋白,它可由病毒感染而自發(fā)產(chǎn)生并隨血液循環(huán)至全身,激活細胞內(nèi)抗病毒作用機制合成各種抗病毒蛋白以抵抗病毒的侵擾。由于它高效的廣譜抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)活性以及其無可替代的臨床應用價值,從人類發(fā)現(xiàn)干擾素開始,就從未停止過對它的探索研究。近年來,各種動物干擾素的研究取得了突破性進展,尤其是α干擾素在抗病毒感染等方面顯出良好的效果。我國是最大的養(yǎng)禽國,然而病毒病一直困擾著我國養(yǎng)禽業(yè),造成養(yǎng)禽業(yè)巨大的經(jīng)濟損失。因此需

2、要干擾素類細胞因子和DNA重組技術生物治療制劑來防治禽類疾病。 本研究著眼于克隆并表達雞α干擾素(ChIFN-α),在體內(nèi)和體外探討重組ChIFN-α蛋白抵抗禽類病毒的效果。具體的研究有以下幾個方面: 1.ChIFN-α基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達 通過PCR從三黃肉雞的肝臟基因組中擴增了ChIFN-α全長基因,序列分析表明ChIFN-α基因全長582bp。亞克隆其成熟蛋白編碼基因489bp,利用基因重

3、組技術構(gòu)建了E.coli/pET-28a(+)-IFNα,使IFNα置于pET-28a的T7啟動子下游并同6×His-Tag(多聚組氨酸標簽)融合。經(jīng)酶切鑒定,DNA測序證實重組質(zhì)粒構(gòu)建正確;經(jīng)SDS-PAGE分析,表達產(chǎn)物為22kD左右的融合蛋白,并且蛋白以不溶性的包涵體形式存在。Westem-blot印跡及斑點雜交分析證實表達產(chǎn)物具有良好的免疫學活性。 2.兩種純化方法獲得的表達蛋白產(chǎn)物的抗病毒效果比較研究 通過

4、提取包涵體法和鎳親和層析法分別對表達產(chǎn)物進行純化,變性和復性,獲得了具有較高生物活性的重組雞干擾素,提純的包涵體可占總蛋白的70%以上,用鎳親和層析方法純化蛋白則可達到95%。對這兩種方法提純的蛋白進行了雞胚試驗和雛雞試驗,分析并比較了它們抵抗禽類病毒的效果,試驗均表明親和層析純化蛋白是包涵體蛋白活性的20倍左右,表明蛋白純度越高,復性越好,生物活性也越好。 3.重組雞α干擾素抗禽類病毒效果 在體外試驗中,復性的蛋白

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