一株中國被毛孢菌絲代謝組學(xué)及生物活性成分研究.pdf

1、本研究利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)并結(jié)合代謝組學(xué)相關(guān)研究方法，對一株采自青海青沙山編號為RCEF5042的中國被毛孢（Hirsutella sinensis）進(jìn)行研究。研究內(nèi)容主要包括:不同培養(yǎng)方式（固體和液體培養(yǎng)）、不同培養(yǎng)時間、不同濃度氧化劑脅迫、不同時間紫外線照射、不同光照（常光和黑暗）及不同繼代培養(yǎng)代數(shù)對菌絲中代謝產(chǎn)物的影響。
　　對不同培養(yǎng)時間代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析表明，菌株RCEF5042在不同的培養(yǎng)時間中，其菌絲中代謝產(chǎn)

2、物發(fā)生了顯著變化，其中差異比較明顯的是培養(yǎng)的第18天與21天之間，24天和27天之間，在這兩個轉(zhuǎn)折點上，培養(yǎng)菌絲所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物發(fā)生了顯著性的差異，因此可將不同培養(yǎng)時間分為前期（19天前）、中期（19-26天）、后期(26天后)三部分。在不同時間的培養(yǎng)過程中，代謝產(chǎn)物在種類和含量上在不斷發(fā)生著變化。本研究確定了多種抗生素和多種具有獨特生物活性的物質(zhì)的變化規(guī)律，在實際生產(chǎn)中可根據(jù)需要有針對性的對中國被毛孢的培養(yǎng)時間進(jìn)行確定。
　　在

3、菌株RCEF5042固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)菌絲體、液體發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液這三者之間的代謝產(chǎn)物差別都比較大。本研究著重分析了在固體培養(yǎng)菌絲中存在的代謝產(chǎn)物，特別是抗生素和具有特殊活性的代謝物。另外，僅在液體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物中，在液體發(fā)酵菌絲體和在發(fā)酵液中的含量也有變化?？筛鶕?jù)實際對代謝物利用的需要來選擇是固體培養(yǎng)還是液體培養(yǎng)。
　　不同濃度氧化劑對菌株RCEF5042的脅迫作用的研究中，分別對相應(yīng)的發(fā)酵菌絲體和

4、發(fā)酵液進(jìn)行分析。在發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液中，樣品中所含的變量的組成或濃度表現(xiàn)出逐步穩(wěn)定變化的趨勢，相鄰氧化劑濃度間差異不明顯，但濃度差異較大的樣品間表現(xiàn)為顯著差異。在發(fā)酵菌絲體中對照組與其他氧化劑濃度間差異明顯;在發(fā)酵液中表現(xiàn)為對照組、每100mL發(fā)酵液中加入2μL30％雙氧水和其他氧化劑濃度間差異明顯。在有氧化劑存在的情況下，有些具有特殊活性的物質(zhì)在降低或消失，而有些抗生素類物質(zhì)在有氧化劑后才檢測到，說明在不同的氧化劑濃度下，代謝物的變化

5、與微生物的抗逆作用有關(guān)。
　　在研究不同時間紫外線照射對菌株RCEF5042的代謝物的影響時發(fā)現(xiàn)，對菌株分別照射10s、20s、30s、40s、50s及不照射所得到的代謝產(chǎn)物之間差異是逐漸變化的，在相鄰兩個紫外線照射時間樣品間差異不大，但在紫外線照射時間相差較大時，其代謝產(chǎn)物差異較為明顯，其中在不照射、紫外線照射10s和其他紫外線照射之間差異相對顯著。在對VIP得分大于1.35的化合物分析時發(fā)現(xiàn)，有些代謝產(chǎn)物在隨著紫外線照射時間增

6、加的情況下，含量在逐漸降低或遇到紫外線就消失，而有些具有細(xì)胞毒活性和抗生素類物質(zhì)在紫外線刺激下才能產(chǎn)生，其他代謝產(chǎn)物則是隨著紫外線照射時間的變化處于波動狀態(tài)。
　　菌株RCEF5042在分別進(jìn)行常光與黑暗培養(yǎng)后對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究表明，菌株RCEF5042在不同的光照條件下培養(yǎng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物差異顯著。有些活性物質(zhì)容易在黑暗下形成，有些則更偏向于光照下;有些抗生素類物質(zhì)在黑暗培養(yǎng)時含量更高，而具有抑菌活性的Massarigenin

7、 A則在常光下含量更高。
　　通過對菌株RCEF5042繼代培養(yǎng)5代的代謝產(chǎn)物究發(fā)現(xiàn)，隨著繼代次數(shù)的增加，菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)生更多變化，同時發(fā)現(xiàn)繼代培養(yǎng)時代謝產(chǎn)物的差異變化不是一個連續(xù)的過程，而是有一個過渡期。在繼代培養(yǎng)的第5代出現(xiàn)了抗炎、抗細(xì)胞毒活性、抗菌活性物質(zhì);在傳代過程中，有些活性物質(zhì)隨著傳代的增加，含量出現(xiàn)逐漸降低或者消失。有關(guān)研究一方面豐富了從微生物中尋找特殊代謝產(chǎn)物的方法，另一方面也給傳統(tǒng)的繼代培養(yǎng)保藏菌種的方法提出了新