DEAF1與候選蛋白質因子相互作用的驗證.pdf

1、目的：擴增Rbm39的cDNA序列，并構建其真核表達質粒載體；建立基于熒光素酶報告基因的蛋白-蛋白相互作用的驗證體系，利用已建立的體系驗證篩選到的候選蛋白質因子與DEAF1的相互作用。
　　方法：（1）利用RT-PCR技術，克隆Rbm39基因的cDNA序列，并構建其真核表達質粒；將質粒轉染入293T和293T-Deaf1細胞中，Western blotting檢測其表達情況；免疫共沉淀技術驗證Rbm39與DEAF1之間的相互作用；

2、（2）從受DEAF1調控的外周組織抗原基因中選出4個基因，其中2個基因啟動子區(qū)帶有DEAF1結合序列，另外2個基因啟動子區(qū)不含DEAF1結合序列；克隆各基因啟動子序列，將這些啟動子序列插入報告基因載體，構建帶有不同基因啟動子序列的熒光素酶報告基因質粒；將報告基因質粒分別轉染入293T和293T-Deaf1穩(wěn)定表達細胞株中，檢測報告基因的熒光素酶活性；（3）將構建好的熒光素酶報告基因質粒與篩選得到的候選蛋白質因子真核表達質粒共轉染入293

3、T-Deaf1穩(wěn)定表達細胞株中，檢測報告基因的熒光素酶活性，驗證候選蛋白與DEAF1之間的相互作用。
　　結果：（1）成功克隆了Rbm39基因的cDNA，構建得到真核表達質粒pEF1/Myc-HisC-Rbm39；（2）pEF1/Myc-HisC-Rbm39能在293T細胞中有效表達，Co-IP檢測結果顯示Rbm39可能與DEAF1之間存在相互作用；（3）成功擴增到了4個基因的啟動子序列，構建了各基因的熒光素酶報告基因質粒；（4）