DEAF1與候選蛋白質(zhì)因子相互作用的驗(yàn)證.pdf

1、目的：擴(kuò)增Rbm39的cDNA序列，并構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒載體；建立基于熒光素酶報(bào)告基因的蛋白-蛋白相互作用的驗(yàn)證體系，利用已建立的體系驗(yàn)證篩選到的候選蛋白質(zhì)因子與DEAF1的相互作用。
　　方法：（1）利用RT-PCR技術(shù)，克隆Rbm39基因的cDNA序列，并構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T和293T-Deaf1細(xì)胞中，Western blotting檢測其表達(dá)情況；免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證Rbm39與DEAF1之間的相互作用；

2、（2）從受DEAF1調(diào)控的外周組織抗原基因中選出4個(gè)基因，其中2個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)帶有DEAF1結(jié)合序列，另外2個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)不含DEAF1結(jié)合序列；克隆各基因啟動(dòng)子序列，將這些啟動(dòng)子序列插入報(bào)告基因載體，構(gòu)建帶有不同基因啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒；將報(bào)告基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入293T和293T-Deaf1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株中，檢測報(bào)告基因的熒光素酶活性；（3）將構(gòu)建好的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒與篩選得到的候選蛋白質(zhì)因子真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293

3、T-Deaf1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株中，檢測報(bào)告基因的熒光素酶活性，驗(yàn)證候選蛋白與DEAF1之間的相互作用。
　　結(jié)果：（1）成功克隆了Rbm39基因的cDNA，構(gòu)建得到真核表達(dá)質(zhì)粒pEF1/Myc-HisC-Rbm39；（2）pEF1/Myc-HisC-Rbm39能在293T細(xì)胞中有效表達(dá)，Co-IP檢測結(jié)果顯示Rbm39可能與DEAF1之間存在相互作用；（3）成功擴(kuò)增到了4個(gè)基因的啟動(dòng)子序列，構(gòu)建了各基因的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒；（4）