兩種新型多重刺激響應(yīng)性納米藥物的制備及其抗腫瘤轉(zhuǎn)移與多藥耐藥研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，腫瘤的轉(zhuǎn)移和多藥耐藥（MDR）的發(fā)生是腫瘤臨床治療失敗的主要原因?；熕幬?、核酸藥物及光熱治療的聯(lián)合應(yīng)用，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移和逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR提供了新的思路。但開發(fā)出高效、安全的藥物載體仍是腫瘤治療中最為迫切并具有挑戰(zhàn)性的關(guān)鍵課題之一。
　　首先將低分子量的聚乙烯亞胺（PEI）與二硫二丙酸反應(yīng)，制備還原響應(yīng)性的二硫鍵交聯(lián)PEI（DSPEI），通過聚乙二醇（PEG）在DSPEI末端引入RGD肽，制得陽離

2、子聚合物RDG-PEG-DSPEI（簡寫RD），進(jìn)一步將其通過配體交換法修飾到金納米棒（GNR）表面，形成一種全新的非病毒基因載體RGD-PEG-DSPEI-GNR（簡寫RDG）。采用靜電凝聚法制備RDG/DNA納米復(fù)合物，并考察該納米復(fù)合物的細(xì)胞靶向特性、近紅外(NIR)激光照射和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）刺激下的基因釋放及在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明：RDG能夠有效的壓縮DNA形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物RDG/DNA。該納米復(fù)合物具有腫瘤細(xì)

3、胞靶向特性，并可被腫瘤細(xì)胞高效攝取。進(jìn)入細(xì)胞后，RDG/DNA復(fù)合物通過GNR“光化學(xué)”介導(dǎo)的內(nèi)體膜破裂和PEI的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，可以輕易的從內(nèi)涵體逃逸出來。進(jìn)一步在 NIR激光照射和細(xì)胞內(nèi)高濃度谷胱甘肽（GSH）作用下，介導(dǎo)DNA有效地釋放出來，從而實(shí)現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)染。
　　為進(jìn)一步考察RDG體內(nèi)核酸藥物的遞送效果，以RDG作為shRNA的輸送載體，采用靜電凝聚法制備RDG/shRNA納米復(fù)合物，并以細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP

4、）報(bào)告基因的表達(dá)為指標(biāo)評(píng)價(jià)其體內(nèi)外干擾效率。結(jié)果表明：RDG/shRNA納米復(fù)合物具有高的穩(wěn)定性和長的血液滯留時(shí)間。納米復(fù)合物經(jīng)尾靜脈注射后，能夠蓄積到腫瘤部位，進(jìn)一步通過RGD肽介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被腫瘤細(xì)胞高效攝取。進(jìn)入細(xì)胞后，RDG/shRNA復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)高濃度GSH作用下解離納米復(fù)合物，導(dǎo)致shRNA有效地釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而實(shí)現(xiàn)高效的基因沉默。表明，RDG是一種非常有前途的可用于高效基因沉默的非病毒載體。
　　以 RDG為載

5、體同時(shí)負(fù)載抗腫瘤轉(zhuǎn)移的p65-shRNA和抗腫瘤增殖阿霉素（DOX），制備RDG/shRNA@DOX納米藥物，以期發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移核酸藥物和
　　抗腫瘤增殖化療藥物的協(xié)同增效作用，進(jìn)而同時(shí)抑制原位腫瘤生長及其遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移?？疾煸摷{米藥物在細(xì)胞內(nèi)GSH和酸性環(huán)境引發(fā)的基因和化療藥物釋放，以高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞及其原位接種裸鼠模型體內(nèi)外評(píng)價(jià)和研究該納米藥物腫瘤靶向性、抗腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖的作用及其機(jī)制。研究表明，RDG/sh

6、RNA@DOX能夠高效的被腫瘤細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)高濃度 GSH和酸性細(xì)胞器作用下，可同時(shí)釋放出DOX和shRNA，進(jìn)而誘導(dǎo)對(duì)MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞的化學(xué)治療和基因沉默，其不僅可以抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而且可以阻礙血管的生成和誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。全身給藥后，RDG/shRNA@DOX納米粒在腫瘤部位蓄積，其不僅可以抑制原位乳腺癌的生長，而且?guī)缀跬耆钄嗔税┘?xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。因此，結(jié)合RGD介導(dǎo)的靶向、細(xì)胞內(nèi)刺激響應(yīng)的

7、藥物控制釋放、RNA干擾和化學(xué)治療，RDG/shRNA@DOX納米藥物在轉(zhuǎn)移性癌的治療中有明顯的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　在GNR藥物遞送系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，制備葉酸（FA）和PEG修飾的金納米棒FA-PEG-GNR(簡寫 FG)，并以其為載體構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和NIR激光照射響應(yīng)性的載阿霉素DOX@FG納米藥物，分別從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平評(píng)價(jià)DOX@FG聯(lián)合NIR照射逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的效果，并對(duì)其可能逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的機(jī)制進(jìn)行了初步的探索。研

8、究表明，DOX@FG能夠高效的被耐藥腫瘤細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)酸性細(xì)胞器中，可釋放出DOX。經(jīng)NIR激光照射，由于GNR光熱作用，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)P-糖蛋白（P-gp）和B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白的表達(dá)下調(diào)，抑制耐藥相關(guān)的細(xì)胞通路，因而不僅可以增加DOX在耐藥腫瘤細(xì)胞的蓄積，而且提高耐藥MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)DOX的敏感性，故而，DOX@FG聯(lián)合NIR照射表現(xiàn)出良好的克服腫瘤耐藥的效果。體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，DOX@FG靜脈注射后并用N