還原響應(yīng)磁性復(fù)合納米藥物抗腫瘤靶向治療的研究.pdf

1、研究背景:
　　惡性腫瘤是危害人類(lèi)生命健康的重大疾病之一，目前的主要治療措施是手術(shù)結(jié)合化療及放療等，但治療效果和預(yù)后都不理想。其中的一個(gè)重要原因在于腫瘤的轉(zhuǎn)移增加了治療的難度?；熓菒盒阅[瘤重要的輔助治療方式，尤其是對(duì)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的癌癥。蒽環(huán)類(lèi)化療藥物是最常用的化療藥物之一，而這類(lèi)藥物的最大副作用就是其劑量累積性心臟毒性，嚴(yán)重限制了其臨床使用。為解決化療所帶來(lái)的副作用，提高藥物的療效，我們將納米技術(shù)應(yīng)用于腫瘤的靶向送藥，并且結(jié)合

2、納米材料的光熱效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)高效靶向性的協(xié)同治療。
　　我們構(gòu)建的磁性復(fù)合納米載體，主要由還原響應(yīng)性?xún)捎H共聚物聚乙二醇聚酯胺(PEG-rPAE)和磁響應(yīng)性超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs)構(gòu)成，再利用其包裹阿霉素構(gòu)成DOX/rPEA@SPIONs，以充分發(fā)揮其多靶點(diǎn)抗腫瘤的能力，最終實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤及轉(zhuǎn)移。對(duì)DOX/rPEA@SPIONs的粒徑分布、藥物的體外釋放行為等理化特性的表征結(jié)果顯示，rPEA@SPIONs粒徑為～200nm、

3、分布均一。在模擬人生理環(huán)境條件下，DOX釋放相當(dāng)緩慢，但在10mM DTT存在的條件下，復(fù)合納米藥物發(fā)生快速降解，導(dǎo)致藥物釋放加快?？蛰d體的近紅外光熱效應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明rPEA@SPIONs在808nm近紅外光照射下具有良好的光熱轉(zhuǎn)換性能和光熱穩(wěn)定性，符合作為光熱治療劑的要求。
　　然后我們?cè)趧?dòng)物水平研究了DOX/rPEA@SPIONs的靶向性、抗腫瘤效應(yīng)和副作用。結(jié)果表明，外加磁場(chǎng)可明顯提高經(jīng)系統(tǒng)給藥的納米復(fù)合物在腫瘤部位的積累。進(jìn)一

4、步熱化療抗腫瘤研究顯示DOX/rPEA@SPIONs結(jié)合光熱治療展現(xiàn)了較好的協(xié)同治療效應(yīng)，使得荷瘤小鼠皮下腫瘤顯著消退并且可以減少臟器毒性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。DOX/rPEA@SPIONs體內(nèi)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的研究結(jié)果表明復(fù)合納米藥物結(jié)合光熱治療可以顯著延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移癌小鼠的生存期，改善生存質(zhì)量，減少轉(zhuǎn)移?？傊瓺OX/rPEA@SPIONs作為磁靶向性的光熱化療納米載藥系統(tǒng)，在腫瘤的臨床治療中的具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　目的:
　　1.制備磁

5、導(dǎo)向性、還原響應(yīng)性、近紅外感應(yīng)性的納米載藥體系，并對(duì)納米顆粒的形態(tài)、磁性和動(dòng)態(tài)散射直徑等進(jìn)行表征，檢測(cè)空載體對(duì)MB49細(xì)胞的毒性。
　　2.利用808nm激光對(duì)不同濃度的rPEA@SPIONs溶液進(jìn)行不同時(shí)間的照射，檢測(cè)其光熱轉(zhuǎn)換性能和光熱穩(wěn)定性。
　　3.利用MTT比色法檢測(cè)納米空載體在NIR照射下，對(duì)MB49細(xì)胞的光熱毒性。
　　4.利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)及普魯士藍(lán)染色，觀察DOX/rPAE@SPIONs在外加磁場(chǎng)

6、引導(dǎo)下的腫瘤靶向積累、器官分布。
　　5.利用HPLC檢測(cè)DOX/rPAE@SPIONs在靜脈給藥后，DOX在小鼠體內(nèi)的血液循環(huán)和生物分布情況。
　　6.通過(guò)建立小鼠MB49膀胱癌皮下腫瘤和肺轉(zhuǎn)移癌模型，探討DOX/rPAE@SPIONs在動(dòng)物水平的抗腫瘤效果。
　　7.通過(guò)觀察小鼠活動(dòng)狀態(tài)、體重變化，檢測(cè)血生化水平以及對(duì)重要臟器進(jìn)行HE和普魯士藍(lán)染色，評(píng)價(jià)納米顆粒在動(dòng)物體內(nèi)的毒副作用。
　　方法:
　　1

7、.DOX/rPAE@SPIONs的合成:由北京中科院高能物理研究所制備并裝載。
　　2.利用透射電子顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射儀和振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)等設(shè)備對(duì)rPEA@SPIONs的大小、粒徑分布、磁性等理化特性進(jìn)行表征，MTT比色法檢測(cè)rPEA@SPIONs對(duì)MB49細(xì)胞的抑制率。
　　3.利用近紅外（808nm，2 W/cm2）激光對(duì)不同濃度的rPEA@SPIONs溶液進(jìn)行不同時(shí)間的照射。記錄rPEA@SPIONs溶液溫度隨照射時(shí)間的

8、變化，檢測(cè)其光熱轉(zhuǎn)換性能。
　　4.選取1mg/mL的rPEA@SPIONs溶液，近紅外(808nm，2W/cm2)激光照射15min。關(guān)閉激光器，待溶液自然冷卻至初始溫度，再開(kāi)啟激光持續(xù)照射15min，如此循環(huán)四次，記錄溫度，檢測(cè)其近紅外光熱穩(wěn)定性。
　　5.檢測(cè)納米材料的光熱毒性，MB49細(xì)胞中加入不同濃度的rPEA@SPIONs，近紅外(808nm，2W/cm2)激光照射15min。37℃，5％ CO2條件下繼續(xù)孵育2

9、4h。加入MTT培養(yǎng)4h，檢測(cè)OD490。
　　6.建立小鼠MB49膀胱癌皮下腫瘤模型:將2×107/mL MB49細(xì)胞混懸液100μL注射于C57BL/6小鼠右后肢皮下。
　　7.DOX/rPAE@SPIONs在磁場(chǎng)引導(dǎo)下的腫瘤靶向性評(píng)價(jià):當(dāng)小鼠腫瘤體積達(dá)到500mm3時(shí)，經(jīng)眼眶靜脈叢分別注射DOX和DOX/rPAE@SPIONs溶液，注射后立即在腫瘤表面加5000Gs的外部磁場(chǎng)。于48h后處死小鼠，取小鼠主要臟器和腫瘤組

10、織進(jìn)行離題成像，觀察比較DOX熒光密度值。
　　8.DOX/rPAE@SPIONs全身給藥后的體內(nèi)循環(huán)和器官分布:給藥方法同方法7，于5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h處死小鼠(n=3)，取血、心、肝、脾、肺、腎和腫瘤，PBS洗凈，HPLC測(cè)定DOX的濃度。
　　9.DOX/rPAE@SPIONs的體內(nèi)抗腫瘤療效評(píng)價(jià):當(dāng)皮下腫瘤平均體積達(dá)80mm3時(shí)，隨機(jī)分為5組(n=6):PBS+NIR組

11、、DOX+NIR組、rPAE@SPIONs+MF+NIR組，DOX/rPAE@SPIONs+MF組和DOX/rPAE@SPIONs+MF+NIR組。眼眶靜脈叢進(jìn)行藥物注射后，立即在腫瘤表面加5000Gs的外部磁場(chǎng)，持續(xù)2h后激光照射腫瘤部位（808nm，0.5W/cm2，5mm，10min）。治療后每?jī)商鞙y(cè)量腫瘤大小，20天后將小鼠處死、取腫瘤組織并稱(chēng)重，進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色及Ki67免疫組化。
　　10.DOX/rPAE

12、@SPIONs在動(dòng)物水平的毒副作用評(píng)價(jià):治療期間，觀察小鼠活動(dòng)狀態(tài)、稱(chēng)體重。治療后第20天，取小鼠全血并收集血清，檢測(cè)血清中ALT、AST、Cre、BUN、TBIL和LDH水平;收集小鼠心、肝、脾、肺、腎固定過(guò)夜，石蠟包埋、切片及HE染色、普魯士藍(lán)染色進(jìn)行組織學(xué)檢查。
　　11.DOX/rPAE@SPIONs對(duì)腫瘤肺轉(zhuǎn)移的療效評(píng)價(jià):靜脈接種腫瘤細(xì)胞后（100μL，2×106/mL），將小鼠隨機(jī)分為四組:PBS+NIR組、DOX+N

13、IR組、rPAE@SPIONs+MF+NIR組，DOX/rPAE@SPIONs+MF+NIR組(n=12)。治療方法同方法9(808 nm，0.5W/cm2，8mm，10min)。治療后隔天觀察小鼠精神活動(dòng)狀態(tài)、存活情況并稱(chēng)量體重，于治療后第20天，每組處死5只小鼠，取心、肝、脾、肺和腎臟，稱(chēng)量肺臟重量后，用苦味酸固定液固定，其他組織4％ PFA固定后制成蠟塊。剩余小鼠繼續(xù)觀察至治療后60天，記錄生存期并繪制生存曲線。
　　結(jié)果:

14、
　　1.TEM圖像和DLS結(jié)果顯示rPAE@SPIONs納米顆粒大小均一，粒徑分布窄，基本呈球形，粒徑為～200 nm。振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明納米顆粒具有超順磁性，在一定磁場(chǎng)作用下能夠發(fā)生定向移動(dòng)。
　　2.所有濃度的rPAE@SPIONs溶液的溫度隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，且隨著其濃度的增加，上升的幅度增大。同一空載溶液在循環(huán)四次反復(fù)照射后，溫度仍能升高至先前水平。
　　3.rPAE@SPIONs在10-1000μ

15、g/mL范圍內(nèi)顯示了很低的細(xì)胞毒性。近紅外光（808nm，1 W/cm2）照射15min后，rPAE@SPIONs的細(xì)胞毒性顯著增加，且與納米顆粒的濃度呈正相關(guān)。
　　4.納米顆粒在外加磁場(chǎng)介導(dǎo)下的腫瘤靶向性:對(duì)腫瘤組織進(jìn)行離體成像結(jié)果顯示，DOX/rPEA@SPIONs+MF組靶向傳遞更多的DOX分子至腫瘤部位，為DOX組的2.5倍，且能維持48h以上，心臟中藥物分布明顯減少。
　　5.HPLC檢測(cè)DOX/rPEA@SPI

16、ONs血液循環(huán)和器官分布結(jié)果顯示，與DOX相比，注射DOX/rPAE@SPIONs組的小鼠肝和脾中具有較高的藥物分布，腫瘤組織中藥物分布明顯升高，心臟中的藥物分布顯著減少，與上述離體成像結(jié)果一致。
　　6.DOX/rPAE@SPIONs的體內(nèi)抗腫瘤療效評(píng)價(jià):治療后第20天，DOX/rPAE@SPIONs組平均腫瘤重量明顯小于其他治療組，抑瘤率達(dá)88.65％。腫瘤組織的HE染色結(jié)果顯示，DOX/rPAE@SPIONs組腫瘤細(xì)胞破壞較

17、嚴(yán)重，細(xì)胞分布疏散。
　　7.DOX/rPAE@SPIONs在動(dòng)物體內(nèi)的毒副作用評(píng)價(jià):不同治療組小鼠的體重未見(jiàn)明顯變化;與PBS組相比，DOX+NIR組ALT、TBIL及LDH水平稍高于PBS組，間接說(shuō)明其肝臟及心臟功能輕度受損;HE染色結(jié)果顯示，DOX/rPAE@SPIONs+MF+NIR組臟器未見(jiàn)明顯異常，而其他四組的肺部均出現(xiàn)轉(zhuǎn)移癌病灶。
　　8.DOX/rPAE@SPIONs對(duì)肺轉(zhuǎn)移癌療效評(píng)價(jià):PBS+NIR組小鼠在

18、第6天時(shí)，即出現(xiàn)體重顯著下降、精神萎靡、行動(dòng)遲緩等惡病質(zhì)的癥狀，第14天時(shí)均死亡。20天時(shí)肺組織苦味酸染色顯示DOX/rPAE@SPIONs+MF+NIR組肺部肉眼可見(jiàn)轉(zhuǎn)移病灶最少，生存期顯著延長(zhǎng)，體重變化平穩(wěn)，在第60天時(shí)全部存活，組織HE染色除肺部外，未見(jiàn)其他轉(zhuǎn)移病灶，而其他三組均出現(xiàn)不同程度的臟器轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:
　　本課題成功合成了包載阿霉素磁靶向性光熱治療納米載藥體系，動(dòng)物水平驗(yàn)證了該體系對(duì)外在磁場(chǎng)具有很好的響應(yīng)