類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠并發(fā)主動脈損傷機(jī)制及阿托伐他汀干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　本課題探討類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）大鼠早期主動脈血管損傷程度及他汀降脂藥對這種損傷的部分保護(hù)機(jī)制，從而為預(yù)防及治療RA所引發(fā)的動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，As）提供臨床用藥的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)采用8周齡大小清潔級重量約190-220g的雄性Wistar大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7日之后,開始造模。將做成的Ⅱ型膠原蛋白乳劑在實(shí)驗(yàn)大鼠的背部離尾部兩

2、厘米皮下打入Ⅱ型膠原蛋白乳劑(0.2mL/只)，制作膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen induced arthritis，CIA)大鼠模型，同時取10只大鼠于與CIA大鼠模型同一部位皮下打入相同量生理鹽水記作空白對照組（N組）。隨機(jī)將造模21d時呈現(xiàn)出二次反應(yīng)的，并且關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分(Arthritis Index,AI)＞5的CIA大鼠分成兩組：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組（RA組）及阿托伐他汀治療組（T組），每組各10只。把阿托伐他汀鈣膠囊內(nèi)的藥

3、粉置于生理鹽水中進(jìn)行充分的溶解并搖勻，制成藥水用以給大鼠灌胃治療。造模后第21天起，T組大鼠用阿托伐他汀（10mg/kg·d）灌胃治療，持續(xù)用藥5周，同時N組及RA組用相同量的生理鹽水進(jìn)行灌胃?？倢?shí)驗(yàn)觀察周期為8周。觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠的一般情況并用電子秤分別于造模前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱量并記錄各實(shí)驗(yàn)組大鼠的體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠腹腔麻醉，經(jīng)腹主動脈采血，離心后留取上層血清置于-80℃冰箱備檢，用于測定各實(shí)驗(yàn)組大鼠的血脂各指標(biāo)、血清妊娠相關(guān)血漿

4、蛋白-A（Pregnancy associated plasma protein-A，PAPP-A）水平、血清腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）水平的差異;取血后快速打開胸腔并統(tǒng)一取大鼠的胸主動脈，置于克氏液中，測量大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能；剩余主動脈經(jīng)固定、脫水、包埋用于HE染色觀察各組大鼠主動脈病理學(xué)變化，免疫組化觀察并半定量分析

5、主動脈內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2/Bax的表達(dá)，脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL法）測定主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)；取大鼠膝關(guān)節(jié)的滑膜組織，固定、脫水、包埋制成蠟塊用于 HE檢測三組大鼠滑膜組織病理學(xué)變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：運(yùn)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-X±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用配對t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較

6、采用X2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，觀察各組大鼠關(guān)節(jié)情況：N組大鼠運(yùn)動量正常，沒有表現(xiàn)出關(guān)節(jié)紅腫和運(yùn)動受限；RA組大鼠運(yùn)動量減少，表現(xiàn)出關(guān)節(jié)紅腫和運(yùn)動受限；T組大鼠活動量、關(guān)節(jié)腫脹度及活動障礙癥狀較RA組有所減輕，但仍存在關(guān)節(jié)腫脹及活動障礙。
　　2.各組大鼠體重的改變情況：造模前各實(shí)驗(yàn)組大鼠重量（g)相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，RA組及T組

7、大鼠重量都較 N組明顯降低（*P＜0.01，**P＜0.01)，但 T組大鼠重量比 RA組明顯要高（＃P<0.01）。
　　3.各實(shí)驗(yàn)組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織HE觀察結(jié)果：N組滑膜上皮細(xì)胞呈現(xiàn)整齊的分布排列；RA組滑膜組織呈乳頭狀增殖，滑膜上皮復(fù)層增殖，滑膜間質(zhì)內(nèi)大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞侵潤，大量新生血管生成，滑膜組織的表面不僅沉積有纖維素樣的物質(zhì)，并且在滑膜組織的間質(zhì)發(fā)生了纖維化；T組滑膜組織病變相對RA組有所緩解，但不明顯，仍呈現(xiàn)出病

8、理狀態(tài)。
　　4.各實(shí)驗(yàn)組大鼠血脂各指標(biāo)、血清PAPP-A、TNF-α和IL-1β水平變化情況：RA組PAPP-A、TNF-α及IL-1β均明顯高于N組(*P<0.01)，HDL-C明顯低于N組(*P<0.05)，而TC、TG、LDL-C無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;應(yīng)用阿托伐他汀治療后，T組TC、LDL-C、PAPP-A、TNF-α及IL-1β均明顯低于RA組(#P<0.05)，HDL-C明顯高于RA組(#P<0.05)，而TG

9、無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　5.各實(shí)驗(yàn)組大鼠的主動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能狀況差異：RA組、T組舒張率（％）明顯低于N組（*P＜0.01，**P＜0.01）；應(yīng)用阿托伐他汀治療后，T組舒張率（%）明顯大于RA組，具有顯著性差別（#P＜0.01）。
　　6.各組大鼠主動脈標(biāo)本 HE鏡下監(jiān)測情況：N組血管內(nèi)皮、內(nèi)膜、中膜及外膜完全整齊無缺失，內(nèi)皮細(xì)胞無增生、無脫落，內(nèi)膜內(nèi)未見泡沫細(xì)胞形成、無淋巴細(xì)胞聚集，平滑肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)沒

10、有表現(xiàn)異常，動脈壁沒有變厚。RA組內(nèi)膜斑塊出現(xiàn)，表面多有不平整，內(nèi)皮細(xì)胞間不連續(xù)，有隆起及脫落出現(xiàn)，有脂質(zhì)沉著和梭形細(xì)胞增生。內(nèi)彈力板、平滑肌細(xì)胞、中膜和外膜沒有發(fā)現(xiàn)明顯異常。T組較RA組病變有所減輕，能夠觀察到不同水平的復(fù)原狀態(tài)。
　　7.免疫組化觀察并半定量分析各實(shí)驗(yàn)組大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2/Bax的表達(dá)結(jié)果：Bcl-2、Bax主要在主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞漿中呈現(xiàn)，免疫組化表達(dá)呈棕黃色；RA組Bcl-2和Bcl-2/Bax

11、的表達(dá)明顯低于N組（*P<0.01），RA組Bax的表達(dá)明顯高于N 組（*P<0.01）；T組Bcl-2和Bcl-2/Bax的表達(dá)明顯高于RA組（#P<0.01），T組Bax的表達(dá)明顯低于RA組（#P<0.01）。8.TUNEL染色法觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡狀況及凋亡結(jié)果分析：各實(shí)驗(yàn)組大鼠均有主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的死亡的存在，RA組的凋亡指數(shù)要明顯大于N組（*P<0.01）；T組的凋亡指數(shù)明顯小于RA組（#P<0.01）。

12、
　　結(jié)論：
　　1.CIA大鼠存在血脂水平異常、血清PAPP-A增高、血清炎癥因子增高及主動脈內(nèi)皮損傷，即證明了其具備As形成的初期條件。
　　2.PAPP-A可能參與了CIA大鼠動脈內(nèi)皮的損傷，為其是否能作為預(yù)測早期動脈粥樣硬化的指標(biāo)提供了有力證據(jù)。
　　3.單獨(dú)應(yīng)用阿托伐他汀能在一定程度上改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎造成的血脂水平紊亂、血清PAPP-A增高、血清炎癥因子增高及主動脈內(nèi)皮損傷。
　　4.阿托伐他汀治