lncRNA-MALAT1調(diào)控ERK-MAPK信號通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、方法：
　?。?）我們收集了蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科2010年3月至2013年4月手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本132例及非瘤腦組織20例，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測比較了lncRNA-MALAT1在膠質(zhì)瘤組織及非瘤腦組織中的表達(dá)水平；
　?。?）以慢病毒為載體，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87和U251中上調(diào)或下調(diào)MALAT1的表達(dá)水平；
　?。?）在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中改變MALAT1的表達(dá)水平后，采用CCK-8試驗(yàn)、免疫組化檢測ki

2、-67表達(dá)水平、流式細(xì)胞周期檢測來評估MALAT1表達(dá)改變對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響；采用Transwell實(shí)驗(yàn)、明膠酶譜實(shí)驗(yàn)評估MALAT1表達(dá)改變對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響；同時，采用western blotting檢測MMP2、MMP9等與侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　（4）將過表達(dá)MALAT1的U87細(xì)胞株及其陰性對照組在裸鼠皮下接種，比較成瘤組織的大小；同時將上述倆組細(xì)胞在裸鼠顱內(nèi)接種，通過免疫組化檢測ki-67及MMP

3、2的表達(dá)水平，以評估MALAT1過表達(dá)對腫瘤增殖、侵襲能力的影響，并且我們進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了顱內(nèi)接種裸鼠的生存曲線。
　　（5）提取過表達(dá)及低表達(dá)MALAT1的U87、U251細(xì)胞的蛋白，通過western blotting，在腫瘤相關(guān)的信號通路中篩選出MALAT1異常表達(dá)后影響最明顯的一條通路。
　　結(jié)果：
　?。?）qRT-PCR結(jié)果顯示：lncRNA-MALAT1在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著低于非瘤腦組織，其結(jié)果具有統(tǒng)

4、計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在不同級別的膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。
　?。?）CCK-8實(shí)驗(yàn)、免疫組化檢測 ki-67表達(dá)實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明低表達(dá)MALAT1能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，而過表達(dá)MALAT1能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖；Transwell實(shí)驗(yàn)及明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低表達(dá) MALAT1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的侵襲，反之亦反；western blotting結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中MALAT1的異常

5、表達(dá)主要影響的侵襲相關(guān)蛋白是MMP2。
　?。?）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，MALAT1過表達(dá)使裸鼠皮下成瘤組織生長減緩，使裸鼠顱內(nèi)成瘤組織ki-67及MMP2表達(dá)水平降低。同時，MALAT1過表達(dá)的U87細(xì)胞株接種于裸鼠顱內(nèi)后其生存時間較其陰性對照組延長。
　?。?）western blotting結(jié)果顯示：在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，MALAT1的異常表達(dá)對ERK/MAPK信號通路影響最顯著，其主要是通過影響該信號通路中P-ERK的表達(dá)水平來調(diào)