慢病毒介導(dǎo)MicroRNA抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建mir-7-3基因慢病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究mir-7-3基因的功能及其在膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。觀察慢病毒介導(dǎo)MicroRNA對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 方法：采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈(RT-PCR)技術(shù)從含有mir-7-3基因的質(zhì)粒pENTR-MIRRNA VECTOR擴(kuò)增目的基因mir-7-3，并將基因克隆到慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒Lt-GFP-RNAi VECTOR[含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因]中，

2、構(gòu)建慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒Lt-GFP-mir-7-3，酶切、測(cè)序驗(yàn)證mir-7-3基因后，將Lt-GFP-mir-7-3質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G共同轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞，獲得攜帶mir-7-3基因和EGFP基因的重組慢病毒FIV-CMV-EGFP-mir-7-3，取濃縮純化后的病毒上清感染293T細(xì)胞和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，熒光顯微鏡觀察293T細(xì)胞的熒光表達(dá)，RT-PCR鑒定U251

3、細(xì)胞中mir-7-3基因的表達(dá)水平。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性EGFR、AKTmRNA及蛋白表達(dá)水平，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性和增殖周期。
　　 結(jié)果：Lt-GFP-mir-7-3共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T能產(chǎn)生高濃度的重組慢病毒FIV-CMV-EGFP-mir-7-3，熒光顯微鏡下能直接觀察EGFP，F(xiàn)IV-CMV-EGFP-mir-7-3中