SHH信號(hào)通路對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖與分化調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見的一種原發(fā)惡性腦腫瘤，也是目前為止中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療效果最差的腫瘤之一。腦膠質(zhì)瘤治療的最大困難在于復(fù)發(fā)，這與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖能力和侵襲性生長(zhǎng)有關(guān)。腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞僅占膠質(zhì)瘤細(xì)胞成分中的少部分，能自我更新和增殖、分化形成與親本形態(tài)和分子表型相同的腫瘤細(xì)胞，連續(xù)移植均能形成與親本相同的腫瘤，是形成不同分化程度膠質(zhì)瘤細(xì)胞的“種子”細(xì)胞，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)中起決定性作用，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞作為細(xì)胞模型。

2、 近年來(lái)通過(guò)對(duì)HH信號(hào)通路的深入研究，發(fā)現(xiàn)HH信號(hào)的異常與人類腫瘤形成有密切的聯(lián)系。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)sHH信號(hào)通路的異常激活，使用抑制劑阻斷sHH信號(hào)通路可抑制腫瘤的生長(zhǎng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中HH信號(hào)通路的異常激活可能導(dǎo)致腦腫瘤形成，使用SHH信號(hào)通路的特異性抑制劑環(huán)杷明(Cyclopamine)能阻止多種原代膠質(zhì)瘤、髓母細(xì)胞瘤及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)。HH信號(hào)通路在腦腫瘤特別是腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生中起重要作用，一些膠質(zhì)瘤和髓母細(xì)胞瘤以及相應(yīng)的模

3、型系統(tǒng)的維持和存活需要sHH信號(hào)通路信號(hào)；SHH信號(hào)通路可能參與了膠質(zhì)瘤的啟動(dòng)，而且通常作用于神經(jīng)前體細(xì)胞或有神經(jīng)干細(xì)胞特性的細(xì)胞。HH信號(hào)通常通過(guò)GLI-1發(fā)揮作用，GLI-1的表達(dá)是細(xì)胞對(duì)Hh信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生反應(yīng)的一個(gè)可靠標(biāo)志，其升高水平可能與腫瘤的級(jí)別有關(guān)。HH信號(hào)也可通過(guò)細(xì)胞周期因子、抗凋亡因子BCL2以及調(diào)控或與其他信號(hào)通路如Notch通路協(xié)同作用等發(fā)揮調(diào)控作用，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。 鑒于SHH信號(hào)通路在NSC或神經(jīng)

4、前體細(xì)胞的自我更新、增殖及分化中起重要作用，而在包括髓母細(xì)胞瘤在內(nèi)的膠質(zhì)瘤和其它多種腫瘤組織及細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)sHH信號(hào)通路的異?；罨?，我們推測(cè)在膠質(zhì)瘤的種子細(xì)胞膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中應(yīng)該也有SHH信號(hào)的異常變化并可能對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，但是究竟如何變化?這些變化又是通過(guò)何種機(jī)制決定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的命運(yùn)及調(diào)控其增殖、分化等生物學(xué)行為?目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)導(dǎo)，值得進(jìn)一步深入研究。 在本課題中，在第一部分實(shí)驗(yàn)中采用以CD133為標(biāo)志的

5、免疫磁珠法從人腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中分離腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Nestin，誘導(dǎo)分化后檢查分化細(xì)胞標(biāo)志物MAP2、GFAP、MBP以及電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察和移植SCID鼠致瘤實(shí)驗(yàn)，對(duì)其干細(xì)胞特性加以鑒定，得到如下結(jié)果：不同病理分級(jí)的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本和膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中存在一小部分CD133+的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，能表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)志物CD133和Nestin，符合干細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，體外培養(yǎng)能連續(xù)傳代；

6、具有多向分化潛能：誘導(dǎo)分化后能產(chǎn)生MAP2、β-TrubulinⅢ、GFAP、MBP染色陽(yáng)性的細(xì)胞；移植SCID鼠后能形成與親本腫瘤表型一致的移植瘤。因此，這一小部分CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞的屬性，就是膠質(zhì)瘤中的腫瘤干細(xì)胞，即膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。 在第二部分實(shí)驗(yàn)中，采用體外分離培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞作為細(xì)胞模型，首先研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、分化培養(yǎng)過(guò)程中SHH信號(hào)通路基因和蛋白的表達(dá)情況，以及腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)情況及細(xì)

7、胞類型，并分析與腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、分化的關(guān)系；在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了針對(duì)人SHH基因的RNA干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中SHH信號(hào)通路的表達(dá)和作用，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)、RT-PCR、Western Blot和流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)對(duì)體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、分化、存活以及移植SCID鼠后致瘤能力的影響，得到如下結(jié)果： 1、腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中有Shh、Gli-1和Bmi-1表達(dá)，而正常成人腦組織中則未能檢

8、測(cè)到；Shh和Gli-1在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)強(qiáng)于低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中；Bmi-1表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)無(wú)明顯關(guān)系。 2、Shh和Gli-1表達(dá)于相對(duì)分化而又未完全成熟的MAP2、GFAP和MBP陽(yáng)性細(xì)胞中，發(fā)育較成熟的細(xì)胞中表達(dá)極弱或檢測(cè)不到；CD133陽(yáng)性細(xì)胞中未檢測(cè)到，提示Shh和Gli-1表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化啟動(dòng)和維持有關(guān)，而且沒(méi)有明顯細(xì)胞特異性。 3、CD133、MAP2、GFAP和MBP陽(yáng)性細(xì)胞中均檢測(cè)到

9、了Bmi-1，CD133和MAP2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)于GFAP和MBP陽(yáng)性細(xì)胞；Bmi-1在相對(duì)幼稚細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)于相對(duì)成熟細(xì)胞，提示Bmi-1強(qiáng)表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞未分化或低分化狀態(tài)維持有關(guān)。 4、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過(guò)程未檢測(cè)到SHH基因mRNA和蛋白表達(dá)，GLI-1基因mRNA和蛋白呈弱表達(dá)，而BMI-1基因mRNA和蛋白呈強(qiáng)表達(dá)，提示在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過(guò)程中有極低水平的Gli-1信號(hào)維持作用，可能與干細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞存活維持有關(guān)。

10、 5、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化時(shí)SHH和GLI-1基因mRNA及蛋白表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)，然后逐漸減弱至消失的過(guò)程，CD133表達(dá)逐漸減弱，MAP2、GFAP和MBP出現(xiàn)表達(dá)并逐漸增強(qiáng)，提示SHH信號(hào)通路表達(dá)可能參與了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化啟動(dòng)和階段性調(diào)控作用。 6、成功構(gòu)建了pSiRNA-SHH和pSiRNA-NC，并經(jīng)PT 67細(xì)胞包裝后生成了相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 7、對(duì)SHH信號(hào)通路進(jìn)行RNAi后，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖受到抑制，

11、存活細(xì)胞減少；G0/G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞出現(xiàn)耗竭或被阻滯于S期，凋亡/壞死細(xì)胞增加，提示SHH信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂和存活有促進(jìn)作用，該作用可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期以促進(jìn)細(xì)胞分裂、減少細(xì)胞凋亡/壞死實(shí)現(xiàn)的。 8、對(duì)SHH信號(hào)通路RNAi后，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化受到抑制，死亡細(xì)胞明顯增加，培養(yǎng)的第3d干擾組中CD133、β-Fubulin Ⅲ、GFAP和MBP陽(yáng)性細(xì)胞所占比例均明顯升高，提示細(xì)胞被阻滯于能同時(shí)表達(dá)上述

12、標(biāo)志物的特定多能干細(xì)胞階段，說(shuō)明SHH信號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化和存活。 9、經(jīng)RNAi-SHH處理后的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞移植SCID鼠后8周未見腫瘤形成，而未經(jīng)處理的同種細(xì)胞在低2個(gè)數(shù)量級(jí)情況下移植也導(dǎo)致腫瘤形成，提示RNAi-SHH對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞移植后致瘤能力產(chǎn)生抑制，但有待更多數(shù)量動(dòng)物原位實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。 總之，通過(guò)本課題的研究，結(jié)果表明：SHH信號(hào)通路的基因和蛋白在腦膠質(zhì)瘤的增殖、分化和存活的過(guò)程中同樣表達(dá)并發(fā)揮重要

13、的調(diào)控作用，不僅促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖和存活，同樣也促進(jìn)并調(diào)控腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分化過(guò)程和存活，該作用可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期以促進(jìn)細(xì)胞分裂、減少細(xì)胞凋亡/壞死實(shí)現(xiàn)的。 同時(shí)應(yīng)看到，SHH信號(hào)僅僅是膠質(zhì)瘤增殖、分化和存活中起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路之一，其他的信號(hào)通路如Notch、WNT、EGF、bFGF信號(hào)通路可能也對(duì)膠質(zhì)瘤增殖、分化和存活起著重要作用，因此，很可能是眾多信號(hào)通路協(xié)同作用，共同完成對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖分化和存活的綜合調(diào)控