洛克沙胂促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中ERK-MAPK信號(hào)通路的研究.pdf

1、洛克沙胂(Roxarsone，Rox)，是一種有機(jī)砷添加劑，具有促生長(zhǎng)，抗球蟲(chóng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率等優(yōu)點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)被廣泛用于畜禽生產(chǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)低濃度的洛克沙胂對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有促進(jìn)作用，但其作用機(jī)制不清楚，研究報(bào)道極少。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及血管生成最重要的調(diào)節(jié)因子，ERK/MAPK是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分裂的重要信號(hào)通路之一。本文在洛克沙胂對(duì)大鼠內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)作用中，通過(guò)特異性抑制劑阻斷VEGF受體(VEGFR)，ERK/MAPK

2、信號(hào)通路中Ras和MEK，研究ERK/MAPK信號(hào)通路在洛克沙胂促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。
　　在大鼠內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)中，洛克沙胂分為0.1μM Rox、1.0μM Rox和10μM Rox三個(gè)組，PBS作為陰性對(duì)照。1.0μM Rox與不同的抑制劑共處理組分為1.0μMRox+anti-VEGFR(1+anti-V)、1.0μM Rox+anti-Ras(1+anti-R)、1.0μM Rox+anti-MEK(1+anti-M)

3、、1.0μM Rox+anti-VEGFR+anti-Ras(1+anti-V+anti-R)、1.0μM Rox+anti-VEGFR+anti-Ras+anti-MEK(1+anti-V+anti-R+anti-M);以及相應(yīng)的抑制劑對(duì)照組:15μManti-VEGFR(anti-V)、10μM anti-Ras(anti-R)、10μM anti-MEK(anti-M)、anti-VEGFR+anti-Ras(anti-V+ant

4、i-R)、anti-VEGFR+anti-Ras+anti-MEK(anti-V+anti-R+anti-M)。運(yùn)用MTT方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞活力，Elisa方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中VEGF的水平，Western-blot和定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)ERK/MAPK信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)及其mRNA水平。
　　MTT法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞處理24 h的細(xì)胞活力顯示:Rox0.1μM組、1.0μM組、10μM組OD值顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.01)

5、，1.0μM Rox組作用最強(qiáng)。VEGFR、Ras、MEK抑制劑與1.0μM Rox共處理組的細(xì)胞活力極顯著低于1.0μM Rox洛克沙胂單獨(dú)處理組(P＜0.01），高于信號(hào)分子單獨(dú)阻斷組。兩種或以上抑制劑聯(lián)合阻斷組的細(xì)胞活力低于單獨(dú)阻斷組。洛克沙胂促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，但特異性阻斷VEGFR、Ras和MEK影響洛克沙胂對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用。
　　內(nèi)皮細(xì)胞不同處理后，Elisa方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中VEGF的含量表明:0.1、1.0和1

6、0μMRox組VEGF含量顯著高于PBS組(P＜0.01)，1.0μM Rox組VEGF含量最高。不同信號(hào)分子抑制劑組VEGF表達(dá)水平極顯著低于正常組(P＜0.01)。1.0μM Rox聯(lián)合或單獨(dú)抑制VEGFR、Ras、MEK信號(hào)分子，VEGF的表達(dá)水平顯著低于1.0μM Rox單獨(dú)處理組，高于信號(hào)分子抑制對(duì)照組。洛克沙胂對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)有促進(jìn)作用;VEGFR、Ras和MEK特異性阻斷時(shí)，影響洛克沙胂對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)。<

7、br>　　Western-blot分析蛋白表達(dá)顯示:與對(duì)照組相比，不同濃度Rox處理內(nèi)皮細(xì)胞Ras、MEK、ERK蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05），但其磷酸化蛋白均顯著升高(P＜0.01)。與1.0μM Rox處理組相比，VEGFR、Ras抑制劑及聯(lián)合Rox處理組Ras蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P-Ras蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01);VEGFR、Ras、MEK抑制劑聯(lián)合1.0μMRox處理組，P-MEK及P-ERK蛋

8、白表達(dá)水平極顯著降低(P＜0.01)。anti-R及anti-V+anti-R處理組P-MEK蛋白表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)抑制劑聯(lián)合1.0μM Rox處理組(P＜0.05);anti-M，anti-V+anti-R，anti-V+anti-R+anti-M處理組P-ERK蛋白表達(dá)水平極顯著低于相應(yīng)抑制劑聯(lián)合1.0μM Rox處理組（P＜0.01）。洛克沙胂影響ERK/MAPK通路相關(guān)信號(hào)蛋白的磷酸化，在洛克沙胂對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用中存在著VEG

9、FR-ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)。
　　定量PCR檢測(cè)mRNA水平表明:1.0μM Rox處理組ras基因表達(dá)水平與正常組相比差異不顯著;一種或多種抑制劑聯(lián)合洛克沙胂組，ras基因表達(dá)顯著低于1.0μM Rox組;且1+anti-V與anti-V差異極顯著(P＜0.01)。1.0μM Rox處理組mek-1基因表達(dá)量顯著高于正常組(P＜0.01)，mek-2基因與正常組相比差異不顯著。一種或多種抑制劑聯(lián)合洛克沙胂組mek-1和m

10、ek-2基因表達(dá)水平顯著低于1.0μM Rox組。三種抑制劑聯(lián)合阻斷時(shí)，與聯(lián)合洛克沙腫處理組相比mek-1基因差異極顯著(P＜0.01)。1+anti-R組與anti-R組比較mek-2基因差異極顯著(P＜0.01)。1.0μM Rox處理組erk-1基因表達(dá)量極顯著高于正常組(P＜0.01)，erk-2基因差異不顯著。一種或多種抑制劑聯(lián)合洛克沙胂處理組，erk-1和erk-2基因表達(dá)量都極顯著低于1.0μM Rox組(P＜0.01)。