Lewisy抗原通過PI3K-Akt及ERK-MAPK信號通路調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、前言：
　　 卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展是一個極其復(fù)雜的多因素的過程,目前對其發(fā)生機(jī)理尚不清楚。細(xì)胞膜表面有許多糖脂、糖蛋白構(gòu)成的復(fù)合物,對細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-分子的識別十分重要,參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、粘附等分子相互作用,與細(xì)胞生長、凋亡、運(yùn)動、分化等重要生命過程密切相關(guān)。細(xì)胞癌變后細(xì)胞膜上的糖復(fù)合物,特別是其糖鏈部分發(fā)生結(jié)構(gòu)和量的變化。卵巢癌主要表現(xiàn)為Ⅱ型糖鏈的改變,如Lewisy抗原。研究表明75%的上皮性卵巢癌出現(xiàn)Lewisy不同程度的過量

2、表達(dá),且表達(dá)增高的患者預(yù)后不良。我們在前期工作中利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將人α1,2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(α1,2-fucosyltransferase,α1,2-FT)基因轉(zhuǎn)入卵巢癌細(xì)胞系RMG-I,建立了Lewisy穩(wěn)定高表達(dá)卵巢癌細(xì)胞系RMG-I-H,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后RMG-I-H細(xì)胞對鉑類、紫杉醇及5-FU等化療藥物敏感性下降,提示Lewisy抗原具有提高卵巢癌細(xì)胞生存能力的作用。
　　 細(xì)胞表面的受體幾乎都是糖蛋白,研究表明,改變糖基轉(zhuǎn)移

3、酶的表達(dá)可影響細(xì)胞表面受體的糖鏈結(jié)構(gòu),繼而影響其表達(dá)數(shù)目及功能,促進(jìn)細(xì)胞增殖。體細(xì)胞通過跨越緊密調(diào)節(jié)的細(xì)胞周期進(jìn)行增殖和分化,細(xì)胞周期的調(diào)控涉及一系列調(diào)控蛋白,這些蛋白表達(dá)量及活性的變化在周期調(diào)控中極為重要。我們在前期工作中利用基因芯片技術(shù)檢測α1,2-FT基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞系癌相關(guān)基因的表達(dá)差異,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中有88種差異性表達(dá)基因,差異基因主要表現(xiàn)在細(xì)胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白氨基酸磷酸化、轉(zhuǎn)錄、凋亡等方面。因此,我們推測Lewis

4、y可能作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的重要結(jié)構(gòu)參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。
　　 本研究主要在前期工作的基礎(chǔ)上,利用已經(jīng)建立的α1,2-FT及Lewisy穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞模型,探討Lewisy抗原促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖的具體作用機(jī)制,為研究卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制奠定基礎(chǔ),為卵巢癌的早期診斷及靶向治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 第一部分:用RT-PCR、WesternBlot及免疫共沉淀等方法研究卵巢

5、癌細(xì)胞系RMG-I轉(zhuǎn)染α1,2-FT基因前后細(xì)胞中胰島素樣生長因子受體-1(Insulin-likegrowthfactorreceptor-1,IGFR-1)與Lewisy基因、蛋白的表達(dá)及兩者的結(jié)構(gòu)關(guān)系,以及抗體阻斷前后IGFR-1酪氨酸磷酸化水平的變化;用免疫組化法檢測卵巢上皮性惡性、交界性、良性腫瘤和正常卵巢組織中Lewisy抗原與IGFR-1的表達(dá)及相關(guān)性,并分析其表達(dá)與卵巢癌組織學(xué)類型、病理分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理參

6、數(shù)的關(guān)系;利用免疫熒光雙標(biāo)記法檢測Lewisy抗原與IGFR-1在卵巢癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。
　　 第二部分:利用流式細(xì)胞儀分析α1,2-FT基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的細(xì)胞周期;采用Real-timePCR方法檢測細(xì)胞中Cyclins,CDKs和CKIs的mRNA水平;利用WestemBlot方法檢測基因轉(zhuǎn)染前后、Lewisy抗體阻斷前后及信號通路抑制劑處理前后細(xì)胞中Cyclins,CDKs和CKIs的蛋白表達(dá)水平。
　　 第三

7、部分:利用RT-PCR、免疫印跡法方法檢測α1,2-FT基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中p27,p-p27,Skp2基因及蛋白的表達(dá);采用免疫共沉淀方法檢測p27泛素化水平;利用Westernblot方法檢測P13K/Akt和ERK/MAPK信號通路抑制劑LY294002,PD98059和抗Lewisy單克隆抗體處理前后細(xì)胞中上述重要分子的變化。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系RMG-I-H中IGFR-1的基因和蛋白表

8、達(dá)水平均上調(diào)(P均＜0.01),但是,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中IGFR-1的酪氨酸磷酸化水平較轉(zhuǎn)染前升高更加明顯(P＜0.01)。免疫共沉淀證明Lewisy為IGFR-1結(jié)構(gòu)上的重要組成部分,IGFR-1上的Lewisy總表達(dá)量為轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的1.81倍,而相對表達(dá)量幾乎無變化(P＞0.05)。在卵巢上皮性惡性腫瘤中,Lewisy抗原的陽性表達(dá)率為88.33%,明顯高于交界性(60.00%)(P＜0.05)、良性(33.33%)(P＜0.01)及正常

9、卵巢組(0);Lewisy抗原的陽性表達(dá)率與卵巢癌臨床病理參數(shù)無關(guān)(P均＞0.05);IGFR-1在卵巢惡性上皮性腫瘤中的陽性表達(dá)率為93.33%,明顯高于交界性(63.33%)(P＜0.05)、良性(53.33%)(P＜0.05)和正常卵巢組(40%)(P＜0.01);IGFR-1的陽性表達(dá)率與臨床分期、組織學(xué)類型、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均＞0.05);在卵巢癌中,Lewisy抗原和IGFR-1的表達(dá)水平隨臨床分期的增加、分

10、化程度的降低而增加,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),與組織學(xué)類型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05);Lewisy抗原和IGFR-1在卵巢癌組織中同時高表達(dá),且其表達(dá)具有正相關(guān)性(P＜0.01)。
　　 第二部分:Lewisy抗原能夠加快卵巢癌細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。Lewisy高表達(dá)導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞中CyclinA,CyclinD1和CyclinEmRNA及蛋白表達(dá)增加,而p16、p21mRNA及其蛋白表達(dá)減少,p27僅蛋白表達(dá)降

11、低,其mRNA表達(dá)沒有改變;CDK2,CDK4和CDK6的mRNA及其蛋白水平在基因轉(zhuǎn)染前后沒有變化。Lewisy抗體、ERK和PI3K通路抑制劑PD98059和LY294002能夠減少Lewisy高表達(dá)引起的Cyelins和CKIs表達(dá)差異。
　　 第三部分:Lewisy高表達(dá)導(dǎo)致p27的核漿分布比例下降,p27蛋白穩(wěn)定性下降,p27多聚泛素化及p27-Thr187磷酸化水平上調(diào),CDK2活性增強(qiáng)及Skp2表達(dá)增加均加快p27

12、蛋白降解,從而導(dǎo)致p27蛋白穩(wěn)定性降低。Lewisy單克隆抗體阻斷可以減少轉(zhuǎn)染前后卵巢癌細(xì)胞中p27和Skp2的表達(dá)差異。PI3K/Akt通路較ERK/MAPK通路在Lewisy調(diào)節(jié)p27和Skp2的表達(dá)方面起主要作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、Lewisy抗原和IGFR-1表達(dá)增加與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān);
　　 2、Lewisy是IGFR-1的重要結(jié)構(gòu);其高表達(dá)不僅增加IGFR-1的數(shù)量,還上調(diào)IGFR-1酪