細(xì)胞因子IGFBP5在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)牙周組織再生中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　目前間充質(zhì)干細(xì)胞已成為牙周組織再生的種子細(xì)胞，然而其定向分化的分子調(diào)控機(jī)制仍未完全明確，限制了其研究及應(yīng)用。IGFBP5作為胰島素樣生長因子軸的重要組成，在骨組織發(fā)育和再生中有著重要作用，然而其在間充質(zhì)干細(xì)胞及牙周組織再生中的作用尚不清楚。本研究探討IGFBP5在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及牙周組織再生中的作用，進(jìn)而可作為潛在的細(xì)胞因子應(yīng)用于組織工程化的牙周組織再生。
　　方法：
　　1.間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取

2、>　　2.構(gòu)建病毒質(zhì)粒
　　通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢IGFBP5的基因序列，設(shè)計IGFBP5基因全長的PCR引物，用PCR的方法得到IGFBP5的全長并加表面標(biāo)記Flag Tag，將其連接到慢病毒的表達(dá)載體上，測序鑒定，最終構(gòu)建成Flag-IGFBP5的質(zhì)粒。
　　3.病毒包裝及收集
　　慢病毒對照空白質(zhì)粒、Flag-IGFBP5的質(zhì)粒及相應(yīng)的包裝質(zhì)粒（△-F8-74和pMDG）在293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48小時后，收集上

3、清，進(jìn)行病毒滴度鑒定，分裝后保存在-80度冰箱。
　　4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立
　　對照質(zhì)粒及Flag-IGFBP5的病毒轉(zhuǎn)染臍帶干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后一周用流式細(xì)胞儀通過篩選標(biāo)記物GFP得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在mRNA和蛋白水平檢測外源性IGFBP5的表達(dá)，得到IGFBP5過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染臍帶干細(xì)胞。
　　5. IGFBP5對干細(xì)胞成骨分化性能影響的體外研究
　　用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液將干細(xì)胞在體外向成骨方向分化誘導(dǎo)。通過測定堿

4、性磷酸酶活性來檢測早期成骨分化指標(biāo)堿性磷酸酶，通過ARS染色及測定鈣離子濃度來檢測晚期成骨指標(biāo)-細(xì)胞礦化能力。并在誘導(dǎo)后3天、7天、10天、2周、3周的不同時間點(diǎn)收獲細(xì)胞，提取mRNA，在RNA水平檢測各個時期成骨分化指標(biāo)，來研究IGFBP5對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。
　　6.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞再生小型豬牙周組織的體內(nèi)研究
　　建立小型豬牙周炎動物模型：采用制造骨缺損、結(jié)扎絲線及局部涂布牙周致病菌P.g的方法建立小型豬實驗

5、性牙周炎模型，在下頜第一恒磨牙近中鄰面形成3 mm×5 mm×7 mm缺損，然后在缺損處放置絲線，局部涂布牙周致病菌P.g。手術(shù)后6周可成功形成牙周炎骨缺損模型。
　　7只五指山小型豬建立牙周炎模型，共14側(cè)，隨機(jī)分為3組：第1組（未治療對照組）：在建模后做翻瓣刮治；第2組（Vector組）：在建模后做翻瓣刮治+Vector轉(zhuǎn)染的臍帶干細(xì)胞；第3組（Flag-IGFBP5組）：在建模后做翻瓣刮治+過表達(dá)IGFBP5臍帶干細(xì)胞。治療

6、后1個月、3個月通過CT影像學(xué)、Geomagic Studio12骨計量分析、牙周臨床指標(biāo)檢查、ELISA和組織病理學(xué)結(jié)果，觀察IGFBP5對臍帶干細(xì)胞介導(dǎo)的小型豬牙周炎缺損組織再生修復(fù)能力的影響。
　　7.統(tǒng)計學(xué)分析
　　用統(tǒng)計軟件SPSS11.5，采用t檢驗或者方差分析，P值小于0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建病毒質(zhì)粒、病毒包裝及收集轉(zhuǎn)染臍帶干細(xì)胞，通過real-time RT-PCR和W

7、estern Blot方法鑒定IGFBP5過表達(dá)效果，結(jié)果顯示IGFBP5過表達(dá)效果達(dá)80％。
　　2.通過測定4d堿性磷酸酶活性、3wARS染色、鈣離子濃度和誘導(dǎo)后1w、2w、3w不同時間點(diǎn)收取的mRNA檢測，結(jié)果顯示與對照組相比，過表達(dá)IGFBP5的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞ALP活性、ARS染色、鈣離子濃度顯著增多，成骨/成牙本質(zhì)的分化指標(biāo)OSX、ON、COL1A2、OPN、DSPP、DMP1的表達(dá)升高。
　　3.通過Geoma

8、gic Studio12三維計算新生骨量、CT影像、牙周臨床指標(biāo)檢查、ELISA及組織病理學(xué)結(jié)果表明：干細(xì)胞治療12w后，與未治療對照組和Vector組相比，F(xiàn)lag-IGFBP5組牙齦緣無紅腫，位置正常；臨床檢查指標(biāo)PD和AL恢復(fù)正常；有大量牙槽骨和新生牙骨質(zhì)生成，新形成的牙周膜纖維附著在牙骨質(zhì)與牙槽骨之間，牙周組織再生良好；齦溝液中炎性因子IL8、IFNr、TNFa、IL1b的表達(dá)量顯著低。
　　結(jié)論：
　　1. IGF