人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞的研究.pdf

1、研究目的:間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一類較原始的干細(xì)胞，具有高度增殖性和多向分化潛能。目前研究較多的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，而臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞近幾年才被人們重視并加以研究。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有相似的增殖特性及多向分化潛能，而且具有取材方便、來源廣泛、免疫原性更低等優(yōu)勢，這是其成為近年來干細(xì)胞研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。本研究建立了分離純化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbili

2、cal cordmesenchymal stem cell，hUC-MSC)的方法，并對其表面標(biāo)志進(jìn)行了鑒定。同時(shí)研究間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，并探討其分化過程中miRNA-27a和miRNA-143的表達(dá)，為闡述間充質(zhì)干細(xì)胞脂向分化的調(diào)控機(jī)制提供了新的思路，并有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　研究方法:在嚴(yán)格無菌條件下，采集健康足月胎兒的臍帶組織，采用酶消化法和組織塊貼壁法進(jìn)行原代細(xì)胞分離培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞儀對其表面標(biāo)記進(jìn)行檢

3、測。將原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并將第5代間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)IBMX、胰島素、吲哚美辛和地塞米松聯(lián)合使用進(jìn)行脂向誘導(dǎo)。利用油紅O免疫組化染色的方法鑒定分化后的細(xì)胞，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比較間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中miRNA-27a和miRNA-143以及它們靶基因的表達(dá)。隨后分析miRNA-27a和miRNA-143以及它們對應(yīng)靶基因的變化趨勢。
　　研究結(jié)果:分離純化后的hUC-MSCs呈均勻有序的成纖維細(xì)胞形態(tài)。臍帶酶消化法培養(yǎng)

4、的細(xì)胞2-3天可見成纖維樣細(xì)胞，3-5天后在倒置顯微鏡下可見散在分布的細(xì)胞集落，貼壁后的細(xì)胞增殖速度較快，原代細(xì)胞培養(yǎng)5天后可見大量細(xì)胞，融合度達(dá)80％。使用組織塊培養(yǎng)法，5-7天可見臍帶組織塊周圍有細(xì)胞爬出，爬出的細(xì)胞隨后貼壁生長，呈短粗梭型或多角形。貼壁后的細(xì)胞增殖速度快，2周左右細(xì)胞可達(dá)80-90％融合。兩種方法下，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90％的融合度時(shí)，按1∶3的比例進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞生長3-6小時(shí)便可貼壁，最初為短粗的梭形或者卵圓

5、形，24小時(shí)后細(xì)胞變?yōu)殚L梭形或多邊形，細(xì)胞均勻分布，平行排列生長或旋渦狀生長，約3天可達(dá)到80％融合。取第5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物，結(jié)果顯示hUC-MSCs高表達(dá)CD44、CD73、CD105、CD166、HLA-ABC，不表達(dá)CD34、CD106，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。在將其定向誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞的過程中，利用吲哚美辛、地塞米松、胰島素以及3-異丁基-1-甲基黃嘌呤四種誘導(dǎo)劑可以使臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為

6、脂肪細(xì)胞的效率達(dá)到90％以上，且絕大多數(shù)為油紅O染色陽性的成熟脂肪細(xì)胞。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測證實(shí)miRNA-27a在MSCs脂向分化的過程中顯著下調(diào)(0.0095±0.002vs1±0.03); miRNA-143的相對表達(dá)量則顯著上調(diào)(17.81±0.88vs1±0.004)。
　　結(jié)論:該研究證實(shí)采用酶消化法和組織塊法均能分離得到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，且均具有高度的增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測符合間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。在體