人臍帶間充質(zhì)干細胞干預(yù)衰老相關(guān)認知功能下降的作用及機制研究.pdf

1、衰老是一種多因素、多器官參與的綜合性現(xiàn)象。當(dāng)個體成熟并隨著年齡增長，機體在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能等方面會出現(xiàn)一系列的退行性變化，而腦是受衰老影響最大的器官之一[1,2]。
　　腦衰老分為生理性變化與病理性變化，前者引起的認知能力減退的現(xiàn)象被定義為衰老性認知(Cognitive aging)[3,4]，其并不被認為是疾病狀態(tài)，后者與阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)。腦衰老在早期表現(xiàn)為與

2、年齡和教育程度相對的學(xué)習(xí)記憶能力或者其它腦功能的減退，并且逐漸發(fā)展為學(xué)習(xí)記憶能力下降、執(zhí)行功能障礙和行為改變等全面性癡呆[5]。
　　生理性腦衰老沒有發(fā)生大量神經(jīng)元凋亡的現(xiàn)象[3,6]，主要表現(xiàn)樹突棘密度的降低，突觸數(shù)量的減少，突觸后膜致密物PSD(Post-synaptic density)的變薄，突觸可塑性以及神經(jīng)發(fā)生能力的下降，這些被當(dāng)作是衰老時學(xué)習(xí)記憶等認知能力下降的重要原因[7-11]。阿爾茨海默病(AD)是一種進行性神

3、經(jīng)退行性疾病，以進行性記憶力減退和獲得性知識喪失、直至完全喪失日常生活活動能力為特征；其兩大病理特征是Aβ沉積形成老年斑(Senile plaque,SP)和Tau蛋白纏結(jié)形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles, NFTs)，另外還有神經(jīng)退行性疾病的共有特征，即大量神經(jīng)元的凋亡[12]。
　　國際阿爾茨海默病協(xié)會(Alzheimer's Disease International,ADI)2016年公布

4、的數(shù)據(jù)，隨著人類壽命的延長，與衰老相關(guān)的認知功能障礙的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[13]。腦衰老伴隨衰老性認知等多種改變，會引起老人生活質(zhì)量的下降，帶來巨大的家庭、社會負擔(dān)；甚至進展為AD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病，帶來更為嚴重的后果，成為嚴重的社會和醫(yī)療衛(wèi)生問題。目前，對衰老相關(guān)認知功能障礙的治療以緩解相關(guān)癥狀的藥物、認知訓(xùn)練、健康的生活方式和飲食療法為主[14]，但干預(yù)治療效果均十分有限。
　　腦的衰老會引起大腦內(nèi)微環(huán)境的改變，進而抑制

5、神經(jīng)發(fā)生能力，破壞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)原有平衡，引起記憶力下降等一系列功能改變[15,16]。近期的研究表明，通過年輕血液的循環(huán)灌注可有效改善年老實驗動物骨骼肌、肝臟、脊髓和腦等多種組織器官內(nèi)干細胞[17,18]的功能狀態(tài)，推測年輕個體來源的血液可能通過某些“年輕”活性因子發(fā)揮作用，通過系統(tǒng)性調(diào)節(jié)，從而延緩和逆轉(zhuǎn)年老個體的衰老相關(guān)病變。盡管這種說法仍有待進一步考證，但這提示我們，可以利用某些“年輕”因子的干預(yù)，通過系統(tǒng)性調(diào)節(jié)衰老個體的神經(jīng)系統(tǒng)，同時

6、激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞，有可能成為有效改善和逆轉(zhuǎn)腦衰老帶來的認知性障礙的新策略。有研究表明，通過間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植可以有效的修復(fù)骨、心臟、肺臟等多種組織器官[19-21]。間充質(zhì)干細胞發(fā)揮其治療作用的方式包括分化替代和通過強大的分泌作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、改善微環(huán)境、促血管新生、抑制凋亡、營養(yǎng)支持等[22,23]。而在眾多間充質(zhì)干細胞中，人臍帶間充質(zhì)干細胞(Human umbilical

7、cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)作為醫(yī)療廢棄物，更加容易獲取、無論理學(xué)爭議，更重要的是其免疫原性更低、處于更早的生命周期、易分離純化[24]，這些使它成為臨床細胞治療更理想的種子細胞[25]。
　　在此基礎(chǔ)上，我們提出假設(shè)：hUC-MSCs作為“年輕”干細胞，在特定條件下能夠分泌大量具有多重功能的細胞調(diào)節(jié)因子等活性物質(zhì)，通過系統(tǒng)性調(diào)節(jié)，可能對改善衰老大腦的生理或病例狀態(tài)具有重要的作用。

8、r>　　為了驗證我們提出的假說，將分為兩個部分開展相關(guān)作用和機制的探索—hUC-MSCs干預(yù)衰老性認知的作用及其機制，以及 hUC-MSCs治療阿爾茨海默病的作用及其機制。我們分別選用D-半乳糖(D-galactose)致衰老小鼠作為研究衰老性認知的模型，SAMP8小鼠(Senescence-accelerated mouse/prone8)作為研究阿爾茨海默病的模型。
　　研究表明，小鼠等嚙齒類動物長期皮下注射高劑量 D-半乳糖

9、，會引起機體代謝紊亂，進而加速其臟器尤其是腦的退行性變化，類似于自然衰老的表現(xiàn)[26]，主要體現(xiàn)在細胞轉(zhuǎn)錄水平降低[27]和海馬區(qū)神經(jīng)再生障礙[28-30]等衰老改變。所以，在本研究中，我們選擇D-半乳糖致衰老小鼠模型作為研究衰老性認知的動物模型。
　　另外，SAMP8小鼠顯示了許多阿爾茨海默病所具有的特性，如行為紊亂、記憶力下降、β淀粉樣蛋白沉積和tau蛋白磷酸化等，它以早期發(fā)生快速老化且伴隨顯著的學(xué)習(xí)記憶能力障礙為特征，且隨增

10、齡而加重[31-33]。SAMP8是自然篩選得到的疾病模型，它的發(fā)育和成長，更加符合自然狀態(tài)下，從腦衰老進展為阿爾茨海默病的過程。因此，在本研究中，我們選擇SAMP8小鼠作為研究阿爾茨海默病的動物模型。
　　由于MSCs直徑大、粘附力強的原因，在小鼠等多個物種上靜脈注射MSCs會引起不同程度肺不張和肺栓塞[34,35]。而有研究稱，通過腹腔注射間充質(zhì)干細胞可以改善小鼠肌肉狀態(tài)、延長小鼠壽命[36]和改善小鼠腦白質(zhì)營養(yǎng)不良[37]。

11、這為我們選擇腹腔移植的方式，來研究 hUC-MSCs是否可以通過分泌途徑改善衰老模型鼠和AD模型鼠的認知能力提供了依據(jù)。
　　我們知道，在人類和小鼠的衰老過程中，大腦海馬極易受損，主要表現(xiàn)為神經(jīng)發(fā)生能力下降、突觸可塑性相關(guān)基因下調(diào)表達、新生神經(jīng)元減少、樹突棘密度降低，并帶來相應(yīng)的突觸可塑性降低和認知功能下降[38,39]。所以，以上指標是我們評判 hUC-MSCs干預(yù)衰老相關(guān)認知功能障礙的主要指標。另外，海馬區(qū)是調(diào)節(jié)情景記憶和空間

12、記憶的主要腦區(qū)[40]，在認知功能的評價上我們采用了評價空間學(xué)習(xí)記憶能力和情景記憶的相關(guān)行為學(xué)實驗：Morris水迷宮、Y迷宮、新物體識別、穿梭箱和條件恐懼實驗等。
　　首先，在衰老性認知模型鼠的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在建模后，模型鼠發(fā)生了一系列的腦衰老特征的改變：空間學(xué)習(xí)記憶功能的下降；CA1（Cornu ammonis1,安蒙氏角1）突觸可塑性下降，CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的樹突棘密度明顯降低；超微結(jié)構(gòu)顯示，在海馬CA1和DG（Denta

13、te gyrus，齒狀回），興奮性突觸的突觸后膜致密物變薄，神經(jīng)元的微絲微管排列紊亂，髓鞘水腫分解，線粒體結(jié)構(gòu)破壞；海馬體內(nèi)，興奮性突觸后膜致密物的主要成分PSD-95表達下降。hUC-MSCs移植后，上述腦衰老的特征得到了明顯的改善。同時，hUC-MSCs能夠通過激活模型鼠大腦中內(nèi)源性神經(jīng)干/祖細胞，從而促進了大腦的神經(jīng)發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，移植的hUC-MSCs能夠通過激活模型鼠大腦海馬內(nèi)ERK-CREB途徑，從而發(fā)揮其干預(yù)作用。<

14、br>　　其次，在AD模型鼠實驗中，hUC-MSCs改善了包括對環(huán)境適應(yīng)能力、探索活力、條件記憶能力、對已知事物的記憶識別能力和空間定位的能力在內(nèi)的認知能力。并且，hUC-MSCs治療小鼠的海馬和皮層內(nèi)，包括P-tau（S396）、GSK-3β、BACE1、APP在內(nèi)的AD相關(guān)蛋白的表達量得到下調(diào)，且其皮層和海馬內(nèi)神經(jīng)干細胞標志 Nestin表達量上調(diào)。進一步，通過高通量篩選、生物信息學(xué)分析和多個AD細胞模型，篩選出關(guān)鍵的作用因子HGF

15、，并且在AD模型鼠上確認了HGF的治療作用。通過體外模型證實，hUC-MSCs能夠通過HGF/c-Met系統(tǒng)介導(dǎo)，激活A(yù)KT通路，進一步抑制GSK-3β的活性，從而下調(diào)Tau蛋白的磷酸化水平，最終修復(fù)受損的神經(jīng)細胞。
　　綜上，兩部分結(jié)果表明，一方面 hUC-MSCs能夠通過分泌途徑在生理性腦衰老方面進行系統(tǒng)性的干預(yù)和改善衰老小鼠腦衰老性特征；另一方面，針對病理性腦衰老的典型疾病狀態(tài)阿爾茨海默病，hUC-MSCs能夠明顯改善AD模