前列腺素E2對體外肌腱細(xì)胞和體內(nèi)肌腱組織生物學(xué)作用的初步研究.pdf

1、研究背景及目的
　　 肌腱病在運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域比較常見，普遍認(rèn)為各種不恰當(dāng)運(yùn)動致肌腱過度重復(fù)使用，肌腱出現(xiàn)微小的撕裂損傷，造成肌腱組織逐漸變性和退變，但其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)：人肌腱細(xì)胞在體外牽伸載荷條件下產(chǎn)生的前列腺素E2(ProstaglandinE2，PGE2)明顯增高，過度運(yùn)動鍛煉后肌腱腱鞘周圍PGE2水平也明顯增加，提示過度的機(jī)械載荷下肌腱細(xì)胞和其周圍結(jié)締組織產(chǎn)生的PGE2有可能在肌腱病發(fā)生發(fā)展過程中起著

2、重要作用。
　　 正常肌腱組織富含膠原蛋白，主要是Ⅰ型膠原，以及少量的Ⅲ型膠原，肌腱病組織主要是膠原基質(zhì)發(fā)生了改變，膠原纖維束連續(xù)性中斷，結(jié)構(gòu)松散、裂隙。退行性病變肌腱及負(fù)荷大的肌腱止點(diǎn)處Ⅲ型膠原增多，肌腱病的動物模型的在體研究發(fā)現(xiàn)肌腱的膠原總量有顯著降低，Ⅲ型膠原增高，在體外培養(yǎng)條件下肌腱細(xì)胞隨傳代次數(shù)的增加，肌腱增殖能力有較大降低，Ⅰ型膠原分泌減少，Ⅰ/Ⅲ型膠原比例倒置。在各種造成肌腱損傷因素下，肌腱膠原基質(zhì)發(fā)生重塑，膠原類

3、型發(fā)生轉(zhuǎn)變，并逐漸積累基質(zhì)惡化。
　　 PGE2是否能導(dǎo)致肌腱細(xì)胞、胞外膠原基質(zhì)和生物力學(xué)的改變尚缺乏直接證據(jù)。為此，我們從肌腱病組織臨床病理學(xué)研究著手，觀察肌腱病組織病理學(xué)特征，分析外源性PGE2對肌腱細(xì)胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白分泌的影響，探明對肌腱組織中膠原類型、膠原含量及生物力學(xué)等影響，初步探討PGE2與肌腱病之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.人肌腱病組織的組織病理學(xué)觀察
　　 臨床收集肌腱病手

4、術(shù)治療中切除的病變肌腱組織和因外傷、截肢等手術(shù)中廢棄的正常肌腱組織，H-E染色比較觀察肌腱細(xì)胞結(jié)構(gòu)、肌腱基質(zhì)形態(tài)，苦味酸-天狼星紅染色在偏光顯微鏡下比較觀察肌腱膠原基質(zhì)變化，分析膠原含量和膠原類型的變化。
　　 2.不同劑量外源性PGE2對體外人肌腱細(xì)胞增殖及胞外基質(zhì)膠原的影響
　　 使用組織塊法和酶消化法分離人肌腱原代細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)與傳代，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫熒光染色法鑒定肌腱細(xì)胞；將肌腱細(xì)胞按1×104

5、數(shù)量級接種96孔培養(yǎng)皿中，分別加入不同劑量PGE2共培養(yǎng)12h、24h、48h，應(yīng)用[3H]-TdR摻入法通過閃爍計(jì)數(shù)測量肌腱細(xì)胞的增殖情況；應(yīng)用Ⅰ、Ⅲ型膠原酶聯(lián)免疫檢測不同劑量PGE2作用肌腱細(xì)胞后培養(yǎng)液中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白分泌量。
　　 3.外源性的PGE2對兔跟腱膠原含量、比例及生物力學(xué)特性的影響
　　 將健康日本短耳兔根據(jù)PGE2注射劑量的不同隨機(jī)分兩組，即50ng組和500ng組，每組動物隨機(jī)選擇一側(cè)后肢跟腱作為

6、實(shí)驗(yàn)側(cè)，對應(yīng)的另一側(cè)為對照側(cè)，實(shí)驗(yàn)側(cè)跟腱注射PGE2，對照側(cè)跟腱注射等量生理鹽水，注射方式為經(jīng)皮注射，注射部位為跟腱中部，注射量為0.2ml，每周注射一次，4周和8周后分別處死兩組實(shí)驗(yàn)動物，收獲兔跟腱標(biāo)本，觀察大體情況，取標(biāo)本進(jìn)行固定包埋切片H-E染色，鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)、基質(zhì)形態(tài)，天狼星紅染色在偏光顯微鏡下觀察組織中膠原成分的變化并應(yīng)用圖像分析軟件定量分析Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，制備電鏡標(biāo)本在透射電鏡下觀測膠原纖維的密度和纖維直徑的變化。另取

7、注射8周后標(biāo)本，應(yīng)用微機(jī)控制電子萬能測試機(jī)對跟腱進(jìn)行力學(xué)測試，比較實(shí)驗(yàn)側(cè)和對照側(cè)跟腱的最大載荷、抗拉強(qiáng)度的變化，比較高、低劑量兩組實(shí)驗(yàn)側(cè)跟腱的最大載荷、抗拉強(qiáng)度的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.與正常肌腱組織比較，肌腱病組織HE染色顯示肌腱組織膠原纖維排列紊亂，結(jié)構(gòu)明顯破壞，天狼星紅組織染色示肌腱組織中黃紅色的Ⅰ型膠原纖維明顯減少，綠黑色的Ⅲ型膠原纖維明顯增多，整個膠原基質(zhì)排列雜亂無章，失去正常肌腱組織結(jié)構(gòu)。
　　

8、 2.兩種方法均能分離培養(yǎng)出人原代肌腱細(xì)胞，且傳代培養(yǎng)生長良好。加入PGE2培養(yǎng)48h時，小劑量的PGE2能促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)，培養(yǎng)24h和12h時，小劑量PGE2對肌腱細(xì)胞增殖影響不明顯(P>0.05)；隨著PGE2劑量增大，能抑制肌腱細(xì)胞增殖(P<0.05)。應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中膠原蛋白分泌情況顯示，不同劑量PGE2作用下肌腱細(xì)胞Ⅰ型膠原的分泌增加不明顯(P>0.05)，Ⅲ型膠原分泌增加明顯(P<0.05)

9、，ColⅢ/ColⅠ的比值增大(P<0.05)。
　　 3.PGE2注射實(shí)驗(yàn)側(cè)跟腱出現(xiàn)同人肌腱病組織類似的表現(xiàn)，即不同程度表面血管化，與腱鞘粘連，彈性差，局部呈灰黃色。與對照側(cè)比較，HE染色顯示兩組實(shí)驗(yàn)側(cè)跟腱組織中膠原纖維的結(jié)構(gòu)均破壞，凌亂、松弛、欠規(guī)整、纖維斷裂；天狼星紅-苦味酸染色顯示實(shí)驗(yàn)側(cè)Ⅲ型膠原纖維大量增加，排列紊亂，Ⅰ型膠原明顯減少，膠原纖維明顯變細(xì)，定量分析顯示實(shí)驗(yàn)側(cè)肌腱內(nèi)Ⅰ型膠原含量明顯低于對照側(cè)(P<0.05)，

10、Ⅲ型膠原含量顯著高于對照側(cè)(P<0.05)，Ⅲ型/Ⅰ型高于對照側(cè)(P<0.05)。高劑量組與低劑量組對比發(fā)現(xiàn)：兩組對照側(cè)無明顯差異，高劑量組實(shí)驗(yàn)側(cè)Ⅲ型膠原纖維增加，Ⅰ型膠原纖維減少，Ⅲ型/Ⅰ型的比值增高(P<0.05)。注射8周與4周對比發(fā)現(xiàn)，兩組8周實(shí)驗(yàn)側(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量均有變化，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。電鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)側(cè)肌腱單位面積內(nèi)膠原纖維密度降低，直徑粗大的纖維比例降低，直徑細(xì)小的纖維比例增加(P<0.05)；兩組實(shí)驗(yàn)

11、側(cè)對比發(fā)現(xiàn)，高劑量組膠原纖維密度和直徑粗大纖維比例更低，直徑細(xì)小纖維比例更高(P<0.05)。力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：8周后兩組中實(shí)驗(yàn)側(cè)跟腱最大載荷和抗拉強(qiáng)度均較對照側(cè)降低(P<0.05)，高劑量組與低劑量組對比發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)側(cè)跟腱最大載荷和抗拉強(qiáng)度降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.肌腱病組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)人肌腱膠原基質(zhì)發(fā)生了明顯變化，膠原基質(zhì)退變、變性，纖維結(jié)構(gòu)破壞；膠原的類型發(fā)生變化，即Ⅰ型膠原減少，Ⅲ型膠原增多；