紫花苜蓿皂苷合成途徑中重要相關基因的克隆、表達分析及遺傳轉化.pdf

1、紫花苜蓿(Medicago sativa L.）在世界范圍內分布廣泛，是世界公認的高產(chǎn)優(yōu)質牧草，莖葉中含有豐富的蛋白質，被譽為“牧草之王”。苜蓿不僅營養(yǎng)豐富，其次生代謝產(chǎn)物苜蓿皂甙( alfalfa saponins）近年來被認為是苜蓿的藥用功能的主要來源：具有良好的降膽固醇、血脂效果，還有抗炎、抗癌、抗菌、殺蟲等藥用及生物活性。目前，對于苜蓿的開發(fā)利用主要集中于提高家畜飼料營養(yǎng)價值及改良飼料加工等方面，然而苜蓿皂甙等次生代謝產(chǎn)物卻極少

2、被研發(fā)成專門的產(chǎn)品或者添加劑應用于生產(chǎn)實踐中。本文將對紫花苜蓿苜蓿皂甙合成途徑中關鍵酶基因進行篩選、克隆和功能分析，為苜蓿品質改良及選育新品種提供新的理論依據(jù)。取得的主要進展如下：
　　1.通過同源克隆法擴增首次獲得紫花苜蓿 SS cDNA序列，該基因含有一個1242 bp最大閱讀框，可編碼一個含413個氨基酸、分子量為47 kDa的蛋白。序列比對發(fā)現(xiàn)，獲得的序列與截形苜蓿SS基因的同源性為97.91％，同時編碼的蛋白也高度相似，

3、相似度為93.53%，說明該基因是紫花苜蓿SS基因，將其命名為MsSS。經(jīng)生物信息學分析，其編碼的蛋白有2個可能的跨膜螺旋區(qū)，其中C末端的疏水區(qū)域可能為膜結合區(qū)域；蛋白結構域包含6個保守區(qū)，其中3個高度保守。
　　2.利用實時定量PCR的方法分析MsSS在紫花苜蓿不同組織和不同非生物脅迫下的表達模式。結果顯示，MsSS在根、莖、葉中均可表達，但存在著一定的組織性表達差異：其在根中表達量最高，其次是葉，莖中表達量最低。同時，MsSS

4、基因的表達受MeJA、ABA、GA3、紫外傷害及黑暗的誘導。紫花苜蓿各組織中 MsSS的表達量受 MeJa誘導后均有上升，同時苜蓿中各組織中總皂苷含量和鯊烯合酶含量及活性也均相應的上升。初步證明， MsSS基因在紫花苜蓿皂苷生物合成中具有重要調控作用。
　　3.將含有全長的MsSS cDNA和C端截短30個堿基的MsSS cDNA插入到原核表達載體pEASY-E2中，在轉化大腸桿菌DE3中，經(jīng)IPTG誘導表達后。結果顯示：全長的M

5、sSS cDNA可在大腸桿菌中表達出分子量大小約為45 kDa蛋白，但均為包涵體蛋白；而含有C末端截短的MsSS cDNA的大腸桿菌中表達出分子量大小約為40 kDa的可溶性及包涵體蛋白。結合跨膜螺旋分析和結構域分析得出：MsSS蛋白C末端的疏水區(qū)域為膜結合區(qū)域。
　　4.構建亞細胞瞬時表達載體 pA7-GFP-MsSS并轉入洋蔥表皮進行亞細胞定位，通過 GFP顯示綠色熒光信號間接確定MsSS基因在細胞內的表達部位。同時結合生物信

6、息學預測分析，只能初步判斷MsSS定位細胞質上。
　　5.將植物超表達載體pBI121-MsSS通過農(nóng)桿菌(EHA105）介導法轉化到紫花苜蓿中，得到轉基因苗后對陽性轉基因苗進行MsSS轉錄水平和總皂苷含量水平的檢測，結果表明轉基因植株中MsSS表達量和總皂苷量均高于野生型紫花苜蓿。
　　6.建立固相萃取(SPE）凈化后紫外分光光度法(UV）快速測定紫花苜蓿中總皂甙含量。最佳提取純化工藝：70%的乙醇溶液超聲輔助提取，離心取