2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)在世界范圍內(nèi)分布廣泛,是世界公認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草,莖葉中含有豐富的蛋白質(zhì),被譽(yù)為“牧草之王”。苜蓿不僅營養(yǎng)豐富,其次生代謝產(chǎn)物苜蓿皂甙( alfalfa saponins)近年來被認(rèn)為是苜蓿的藥用功能的主要來源:具有良好的降膽固醇、血脂效果,還有抗炎、抗癌、抗菌、殺蟲等藥用及生物活性。目前,對于苜蓿的開發(fā)利用主要集中于提高家畜飼料營養(yǎng)價值及改良飼料加工等方面,然而苜蓿皂甙等次生代謝產(chǎn)物卻極少

2、被研發(fā)成專門的產(chǎn)品或者添加劑應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。本文將對紫花苜蓿苜蓿皂甙合成途徑中關(guān)鍵酶基因進(jìn)行篩選、克隆和功能分析,為苜蓿品質(zhì)改良及選育新品種提供新的理論依據(jù)。取得的主要進(jìn)展如下:
  1.通過同源克隆法擴(kuò)增首次獲得紫花苜蓿 SS cDNA序列,該基因含有一個1242 bp最大閱讀框,可編碼一個含413個氨基酸、分子量為47 kDa的蛋白。序列比對發(fā)現(xiàn),獲得的序列與截形苜蓿SS基因的同源性為97.91%,同時編碼的蛋白也高度相似,

3、相似度為93.53%,說明該基因是紫花苜蓿SS基因,將其命名為MsSS。經(jīng)生物信息學(xué)分析,其編碼的蛋白有2個可能的跨膜螺旋區(qū),其中C末端的疏水區(qū)域可能為膜結(jié)合區(qū)域;蛋白結(jié)構(gòu)域包含6個保守區(qū),其中3個高度保守。
  2.利用實(shí)時定量PCR的方法分析MsSS在紫花苜蓿不同組織和不同非生物脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果顯示,MsSS在根、莖、葉中均可表達(dá),但存在著一定的組織性表達(dá)差異:其在根中表達(dá)量最高,其次是葉,莖中表達(dá)量最低。同時,MsSS

4、基因的表達(dá)受MeJA、ABA、GA3、紫外傷害及黑暗的誘導(dǎo)。紫花苜蓿各組織中 MsSS的表達(dá)量受 MeJa誘導(dǎo)后均有上升,同時苜蓿中各組織中總皂苷含量和鯊烯合酶含量及活性也均相應(yīng)的上升。初步證明, MsSS基因在紫花苜蓿皂苷生物合成中具有重要調(diào)控作用。
  3.將含有全長的MsSS cDNA和C端截短30個堿基的MsSS cDNA插入到原核表達(dá)載體pEASY-E2中,在轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后。結(jié)果顯示:全長的M

5、sSS cDNA可在大腸桿菌中表達(dá)出分子量大小約為45 kDa蛋白,但均為包涵體蛋白;而含有C末端截短的MsSS cDNA的大腸桿菌中表達(dá)出分子量大小約為40 kDa的可溶性及包涵體蛋白。結(jié)合跨膜螺旋分析和結(jié)構(gòu)域分析得出:MsSS蛋白C末端的疏水區(qū)域?yàn)槟そY(jié)合區(qū)域。
  4.構(gòu)建亞細(xì)胞瞬時表達(dá)載體 pA7-GFP-MsSS并轉(zhuǎn)入洋蔥表皮進(jìn)行亞細(xì)胞定位,通過 GFP顯示綠色熒光信號間接確定MsSS基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。同時結(jié)合生物信

6、息學(xué)預(yù)測分析,只能初步判斷MsSS定位細(xì)胞質(zhì)上。
  5.將植物超表達(dá)載體pBI121-MsSS通過農(nóng)桿菌(EHA105)介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到紫花苜蓿中,得到轉(zhuǎn)基因苗后對陽性轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行MsSS轉(zhuǎn)錄水平和總皂苷含量水平的檢測,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株中MsSS表達(dá)量和總皂苷量均高于野生型紫花苜蓿。
  6.建立固相萃取(SPE)凈化后紫外分光光度法(UV)快速測定紫花苜蓿中總皂甙含量。最佳提取純化工藝:70%的乙醇溶液超聲輔助提取,離心取

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