肝肺綜合征患者血清調(diào)節(jié)人LFs肌樣分化及增殖、遷移作用的研究.pdf

1、肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)是慢性肝病患者所發(fā)生的肺部并發(fā)癥，常伴隨有門(mén)肺高壓和肺內(nèi)血管擴(kuò)張導(dǎo)致的嚴(yán)重低氧血癥。肺微血管擴(kuò)張和再生所導(dǎo)致的氣體交換異常是HPS特征性的病理生理改變。HPS常見(jiàn)于肝硬化患者終末期，目前常用動(dòng)脈血?dú)狻⒃鰪?qiáng)對(duì)比超聲心動(dòng)圖、肺灌注掃描和肺血管造影來(lái)確診是否HPS患者肺部存在特征性的肺血管異常。臨床上除肝移植外，現(xiàn)無(wú)有效治療肝肺綜合征的方法，因此其嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和導(dǎo)

2、致高死亡率。前期研究發(fā)現(xiàn):肺血管重建(pulmonary vascular remodeling，PVR)可能是其主要發(fā)病機(jī)制之一。其病理生理進(jìn)程是一個(gè)由多種細(xì)胞共同參與、相互影響的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)共同作用的結(jié)果，非肌性血管部位出現(xiàn)平滑肌樣細(xì)胞、肌性血管中膜和外膜增厚、內(nèi)膜斑塊形成，致使肺PVR發(fā)生;肺動(dòng)脈平滑肌大量增殖，并從血管中層遷移至血管內(nèi)膜，使整個(gè)肺微血管擴(kuò)張和重建。
　　肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast，MF)是成纖維細(xì)

3、胞的特殊分化類(lèi)型，其超微結(jié)構(gòu)特征介于成纖維細(xì)胞和PASMCs之間，是屬于PASMCs樣細(xì)胞中的一種。既往研究認(rèn)為PASMCs從中膜遷移到內(nèi)膜大量增殖，其細(xì)胞表型也由高分化的收縮型轉(zhuǎn)換為未分化的合成型，PVR的病理變化是血管內(nèi)膜PASMCs大量堆積所致。然而越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)外膜成纖維細(xì)胞、成纖維母細(xì)胞在低氧等刺激因素作用下，活化形成MFs，因此我們推測(cè)活化的MFs可能遷移至內(nèi)膜并大量增殖，直接參與PVR內(nèi)膜大量堆積PASMCs的形成。但

4、是，具體的機(jī)制尚不清楚。前期已經(jīng)做了關(guān)于肝肺綜合征患血清對(duì)SD大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)換的影響的相關(guān)研究，其結(jié)果是肝肺綜合征患者血清可促進(jìn)PASMCs向合成表型的轉(zhuǎn)換，并增強(qiáng)其增殖、遷移能力。由此推測(cè):HPS血清中的細(xì)胞因子釋放，進(jìn)入血液循環(huán)后達(dá)到肺臟，刺激血管外膜LFs(Lungfibroblast.LFs)，使LFs增殖遷移和發(fā)生肌樣分化，最終導(dǎo)致肺血管的病理性重建和HPS的發(fā)生發(fā)展。本課題通過(guò)體外培養(yǎng)

5、成人LFs，模擬生理?xiàng)l件下HPS患者血清對(duì)人LFs肌樣分化，增殖及遷移變化的影響，探索LFs在HPS患者血管重建中所起到的作用，從而為HPS的防治提供新的靶點(diǎn)。
　　研究?jī)?nèi)容:
　　1、培養(yǎng)及鑒定人肺原代LFs，原代LFs培養(yǎng)3-4天后傳代，運(yùn)用光鏡、免疫熒光染色法進(jìn)行鑒定。
　　2、肝肺綜合征患者血清的收集，按照入選標(biāo)準(zhǔn)篩選合格的HPS患者與健康對(duì)照組，并且按要求抽取少量外周血液提取血清。
　　3、分別用正常和

6、肝肺綜合征患者血清刺激人LFs，免疫組化檢測(cè)細(xì)胞SM-α-actin的表達(dá)情況。
　　4、分別用正常和肝肺綜合征患者血清刺激人LFs，Western blot檢測(cè)其SM-MHC和SM-α-actin蛋白的變化情況。
　　5、分別用正常和肝肺綜合征患者血清刺激人LFs，用3H-TdR和transwell法檢測(cè)各組LFs的增殖和遷移能力。
　　研究結(jié)果:
　　1、在倒置顯微鏡下觀(guān)察原代培養(yǎng)的人LFs，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形和針

7、狀形態(tài)為主，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞間界限清楚，立體折光率高，彼此間連接成網(wǎng)狀。通過(guò)波形蛋白vimentin免疫熒光染色鑒定為L(zhǎng)Fs。
　　2、肝肺綜合征患者血清的收集，-80度凍存待用。
　　3、免疫組化法結(jié)果，與正常血清處理組比較，肝肺綜合征患者血清組培養(yǎng)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，核呈桿狀或橢圓狀，細(xì)胞胞漿有大量棕黃色顆粒沉積。正常者的血清刺激細(xì)胞在倒置顯微鏡下單層貼壁生長(zhǎng)，狀如梭形或三角形，胞核清晰，胞漿豐富，SM-α-actin免疫化學(xué)染

8、色胞內(nèi)未見(jiàn)明顯的棕黃色沉淀。
　　4、western bolt檢測(cè)顯示:實(shí)驗(yàn)組SM-α-actin、SM-MHC蛋白表達(dá)上調(diào)，尤其在48h(T2)和72h(T3)時(shí)間點(diǎn)，肝肺綜合征血清刺激SM-α-actin、SM-MHC蛋白表達(dá)明顯增加，呈時(shí)間依賴(lài)的遞增趨勢(shì)(P＜0.05)，而正常血清組無(wú)明顯變化。
　　5、3H-TdR檢測(cè)和transwell檢測(cè)，與對(duì)照組相比，體外實(shí)驗(yàn)中，HPS血清使人肺2代LF的遷移、增殖能力增強(qiáng)，尤