miR-9調(diào)控MYOCD在肝肺綜合征相關PASMCs表型轉(zhuǎn)換及異常增殖中的機制研究.pdf

1、目的:
　　肝肺綜合征(Hepatopulmonary syndrome，HPS)是一種致死性的終末期肝病相關并發(fā)癥，其典型三聯(lián)征為進行性慢性肝病(chronic liver diseases，CLD)，肺內(nèi)微血管擴張(intra-pulmonary microvascular dilation，IPVD)和難治性低氧血癥(serious hypoxemia)。其在慢性肝病患者中的發(fā)病率較高(約為4％-47％)，生存率較低(約為4

2、1％)。到目前為止，除了原位肝移植(liver transplantation，LT)肝肺綜合征仍缺乏有效治療。我們前期研究發(fā)現(xiàn)肝肺綜合征大鼠血清能夠刺激肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smoothmuscle cells，PASMCs)的表型轉(zhuǎn)換和異常增殖，兩者作為肝肺綜合征相關肺血管重建(pulmonary vascular remodeling，PVR)的典型病理變化具有重要的研究價值。
　　心肌素蛋

3、白(myocardin，MYOCD)作為血清應答因子(serum response factor，SRF)的轉(zhuǎn)錄水平激動劑，參與促進平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)相關表型基因表達;抑制細胞周期。研究證實，心肌素蛋白在心臟及大量成熟平滑肌細胞中均有表達。近來研究表明，心肌素蛋白在肺血管重建及多種增殖性血管疾病中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　microRNAs(miRNAs)作為一種非編碼RN

4、A，通過降解/轉(zhuǎn)錄抑制mRNA進而負性調(diào)控相關基因表達。這種轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控參與影響多種生物學過程，例如:細胞增殖及分化;特定細胞類型功能;多種心血管疾病。自從2007年第一篇關于miRNA調(diào)控VSMCs的文章發(fā)表后，相繼miR-143/145，miR-21和miR-20a被證實在VSMCs生物學的多個方面發(fā)揮作用。然而，在HPS相關PVR中microRNA/MYOCD信號通路的調(diào)控作用尚不明確。因此，本研究擬探索是否存在miRNAs通過

5、靶向調(diào)控MYOCD參與HPS的發(fā)生發(fā)展。
　　方法:
　　1.構建體內(nèi)CBDL動物模型及體外PASMCs模型
　　采用慢性膽總管結扎(common bile duct ligation，CBDL)法構建大鼠HPS模型;從CBDL大鼠體內(nèi)提取動脈血并制備血清。原代PASMCs細胞從正常SD大鼠體內(nèi)提取，DMEM(低糖)+10％胎牛血清培養(yǎng)，4-9代用于后續(xù)實驗。
　　2.生物信息學分析;CBDL大鼠血清刺激下PAS

6、MCs內(nèi)預測miRNAs、myocardin、分化表型相關蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表達水平檢測
　　運用相關生物信息學軟件(Targetscan、miRanda和miRDB)預測靶向調(diào)控MYOCDmRNA3'-UTR的miRNAs.正常大鼠血清或CBDL大鼠血清分別干預PASMCs24h(T1)、48h(T2)、72h(T3)后，qRT-PCR法檢測選取的miRNAs(miR-1、miR-9、miR-128和m

7、iR-186)及myocardin mRNA的表達水平。Western blotting法檢測myocardin和分化表型相關蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表達水平。
　　3.miR-9的功能性分析
　　PASMCs轉(zhuǎn)染miR-9抑制劑，Western blotting法檢測myocardin和分化表型相關蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表達水平。進而，采用qRT-PCR法和雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗

8、證miR-9與MYOCD的靶向調(diào)控關系。
　　4.miR-9/MYOCD信號通路的功能性分析
　　PASMCs分別轉(zhuǎn)染miR-9抑制劑/MYOCD過表達質(zhì)粒。Western blotting法檢測分化表型相關蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表達水平;3H-TdR和CCK-8法檢測PASMCs的增殖水平。
　　結果:
　　1.CBDL大鼠血清上調(diào)PASMCs內(nèi)miR-9表達水平，下調(diào)myocardin

9、mRNA及蛋白表達水平，誘導PASMCs表型轉(zhuǎn)換。
　　CBDL大鼠血清刺激下miR-9表達水平呈時間依賴性上調(diào)(2.8-、4-and5.2 fold)，miR-1上調(diào)(2-fold)，miR-128及186表達水平?jīng)]有明顯改變;myocardin mRNA及蛋白表達水平呈時間依賴性下調(diào);PASMCs內(nèi)分化表型相關蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)表達水平呈時間依賴性下調(diào)。
　　2.miR-9參與調(diào)控CBDL大鼠血清

10、誘導的PASMCs表型轉(zhuǎn)換。
　　miR-9抑制劑有效上調(diào)CBDL大鼠血清刺激下PASMCs內(nèi)myocardin和分化表型相關蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表達水平。
　　3.miR-9靶向調(diào)控MYOCD mRNA。
　　qRT-PCR法和雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證實，miR-9通過直接靶向結合MYOCDmRNA3'-UTR調(diào)控其表達。
　　4.miR-9/MYOCD信號通路參與調(diào)控CBDL大鼠血清誘