人工合成熒光蛋白的表達、性質(zhì)鑒定和亞細胞定位及其突變體的構(gòu)建和性質(zhì)鑒定.pdf

1、熒光蛋白易于和其他蛋白融合,且融合后的熒光蛋白具有保持熒光激發(fā)活性的優(yōu)點,其被廣泛地應(yīng)用于細胞學、醫(yī)學和分子學領(lǐng)域。然而,熒光蛋白研究方法的發(fā)展對熒光蛋白的種類也提出了更多的要求。而傳統(tǒng)的獲得熒光蛋白的方式主要局限于從生物體內(nèi)直接提取或通過定點誘變和突變的技術(shù)來獲得,而對利用基網(wǎng)合成的方法合成新型熒光蛋白的研究則很少。
　　 本文在利用微流體PicoArray芯片合成熒光蛋白寡核苷酸和體外組裝的基礎(chǔ)上,獲得了熒光蛋白全長大小的一

2、系列基因片段,然后將基因克隆到融合表達載體pET-28a(+)中,篩選后得到融合有熒光蛋白的表達質(zhì)粒pET-28a(+)-FP,(本文主要對其中三種熒光蛋白B11,E6和H3進行性質(zhì)鑒定)經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,根據(jù)熒光蛋白表達的影響因素進行了熒光蛋白表達條件的優(yōu)化,獲得了熒光蛋白的最佳表達條件,然后利用終止蛋白表達和不同時間點取樣測定熒光強度的方法獲得了熒光蛋白的成熟時間。在熒光蛋白最佳表達條件和成熟時間的基礎(chǔ)上,

3、對熒光蛋白進行大量表達,并利用Ni-IDA親和層析的方法對FP-His tag進行初步純化和FPLC分子篩進一步純化后,得到了純化度在95％之上符合后續(xù)性質(zhì)鑒定的熒光蛋白。質(zhì)譜結(jié)果顯示三種熒光蛋白的分子最和理論值相符。吸收光譜結(jié)果顯示B11,E6的光吸收峰分別在484 nm、547 nm:H3的吸收峰有兩個分別為385 nm和501 nm,說明H3在其熒光發(fā)色基團成熟過程中經(jīng)歷較長的中間體階段;熒光蛋白的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜結(jié)果顯示B11

4、,E6和H3的最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是484 nm,510 nm;535 nm,560 nm和540 nm,565 nm,即熒光蛋白E6和H3屬于較長波長的熒光蛋白。對比B11,EBFP和EGFP熒光蛋白的光譜學性質(zhì),并結(jié)合其三級結(jié)構(gòu)推論出B11的第145位殘基對其量子產(chǎn)率有重要的作用,設(shè)計引物引入突變點F145Y,經(jīng)過分段PCR和重疊PCR得到含有目的突變位點的熒光蛋白基因的全長片段,經(jīng)鑒定后表達并純化B11突變體,測定其量子產(chǎn)率

5、,結(jié)果顯示B11突變體的量子產(chǎn)率是0.24大于B11的量子產(chǎn)率(0.18),結(jié)果和推測相符。為了證明獲得的熒光蛋白是否可應(yīng)用于哺乳動物Hela細胞,構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-G2-HexaHis真核質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染Hela細胞后顯示有很強的熒光信號,激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),熒光蛋白主要分布在Hela細胞質(zhì)中。
　　 以上結(jié)果證實了人工合成獲取新熒光蛋白方法的可行性,同時獲得的熒光蛋白性能優(yōu)良是蛋白定位,基因轉(zhuǎn)錄強度測定,蛋白