人工合成熒光蛋白與重組FLAG標簽融合蛋白的構(gòu)建、表達及鑒定.pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)源于多管水母等海洋無脊椎動物，是一種在生物化學和細胞生物學中得到廣泛應用，具有熒光特性的監(jiān)測細胞或組織內(nèi)基因表達和蛋白質(zhì)定位的標記物。但為滿足日益提高的技術(shù)要求，大量性質(zhì)優(yōu)良的熒光蛋白突變體的應用需求變得迫切起來。通過微流體芯片技術(shù)與合成生物學方法合成新型熒光蛋白基因，篩選獲得5個新型熒光蛋白，對其中一個紅色熒光蛋白(H10)和一個綠色熒光蛋白(G2)的性質(zhì)進行了鑒定。設計多組實驗對新型熒光蛋白的在活體菌株的生長速

2、率、熒光蛋白成熟時間、熒光蛋白表達速度、熒光蛋白光譜學性質(zhì)進行研究，并通過Ni-IDA和FPLC層析兩步純化獲得高純度的熒光蛋白，質(zhì)譜分析熒光蛋白的分子量。以FLAG標簽的原始序列DYKDDDDK
　　 (FLAG4)為模板，設計4種新FLAG標簽FLAG1(DYKDYKYK),FLAG2(DYKGGGYK)．FLAG3(DYKDYKDYK)和FLAG5(DYKDEDDK)與G2、H10融合，通過PCR反應分別將以上五種FLAG

3、標簽融合到熒光蛋白基因的C端，得到重組表達質(zhì)粒pET28a-FP-FLAG。在大腸桿菌BL21(DE3)細胞中表達重組蛋白，純化獲得高純度的融合蛋白，Western blotting分析篩選單克隆抗FLAG M2抗體(AFM2)特異性識別的融合蛋白，采用非競爭性ELISA固相法，經(jīng)確定最佳抗原包板濃度、最佳抗原包板時間及最佳抗原與抗體結(jié)合反應時間后，得到了FP-FLAG與AFM2的抗原抗體結(jié)合反應曲線，計算出FP-FLAG與AFM2的親

4、和常數(shù)。
　　 結(jié)果：顯示新型熒光蛋白G2,H10分子量分別28.187kD，27.091kD，不僅能夠正常的發(fā)揮熒光蛋白的生物學功能，且具有成熟速率更快、發(fā)光強度更強和發(fā)射波長更長的優(yōu)點。PCR擴增、雙酶切及DNA測序鑒定表明重組質(zhì)粒pET28a-FP-FLAG.構(gòu)建正確。SDS-PAGE分析顯示在30kDa左右的位置有一條特異性蛋白條帶，與預期值相符，該系列重組蛋白以可溶性形式存在于菌體裂解液上清中。Western blot

5、ting分析表明單克隆抗FLAG M2抗體(AFM2)能夠特異性識別G2-FLAG4、G2-FLAG5、H10-FLAG3、H10-FLAG4、H10-FLAG5五種FP-FLAG融合蛋白。AFM2與G2-FLAG4、G2-FLAG5的親和常數(shù)分別為1.67E+11、4.65E+10,AFM2與H10-FLAG3、H10-FLAG4、H10-FLAG5的親和常數(shù)分別為6.49E+10、1.47E+11、6.63E+10。結(jié)果表明FLAG

6、原始序列FLAG4(DYKDDDDK)與AFM2之間的親和力最高，F(xiàn)LAG5(DYKDEDDK)與FLAG3(DYKDYKDYK)次之，F(xiàn)LAG1(DYKDYKYK)和FLAG2(DYKGGGYK)最弱。
　　 利用合成生物學和微流體芯片技術(shù)合成的新型熒光蛋白，不僅正常的發(fā)揮熒光蛋白的生物學功能，且具有成熟速率更快、發(fā)光強度更強和發(fā)射波長更長的優(yōu)點。其本身作為一種標記物，與重組FLAG標簽融合，形成一個既具有FLAG標簽功能又含