氟、砷聯(lián)合暴露對成骨細(xì)胞OPG-RANKL軸及WNT-β-catenin信號通路的影響.pdf

1、目的：本研究以氟砷染毒的成骨細(xì)胞（OB）為研究對象，以成骨細(xì)胞增殖變化過程中OPG/RANKL軸及Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白、基因的表達(dá)和改變?yōu)榍腥朦c(diǎn)，分別觀察OPG/RANKL軸及Wnt/β-catenin信號通路在氟、砷和氟與砷暴露對成骨細(xì)胞的作用，以期為探尋氟砷聯(lián)合骨骼毒作用的分子機(jī)制，尋找氟砷聯(lián)合中毒骨骼損害基因靶標(biāo)、干預(yù)位點(diǎn)及氟骨癥的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　方法:1.細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定：將采用胰蛋白酶和

2、膠原酶消化法從新生SD大鼠顱蓋骨分離并經(jīng)差速貼壁法純化得到的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶及茜素紅化學(xué)等方法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。2.劑量設(shè)計(jì)與分組：根據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定氟、砷及氟砷聯(lián)合染毒劑量：單獨(dú)氟染毒劑量為0、0.01、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 mmolF-/L，單獨(dú)砷染毒劑量為0.1、1.0、10.0μmolAs3+/L；根據(jù)各單獨(dú)染毒組OB增殖與分化情況選擇增殖變化較明顯的氟（0.5、4.0 mmo

3、l F-/L）和砷（0.1、10.0μmol As3+/L）進(jìn)行析因設(shè)計(jì)，分別為對照組（0 mmol F-/L+0 umol As3+/L）、低氟組（簡稱F0.5組）、高氟組（簡稱F4.0組）、低砷組（簡稱As0.1組）、高砷組（簡稱As10.0組）、低氟低砷組（簡稱F0.5As0.1組）、低氟高砷組（簡稱F0.5As10.0組）、高氟低砷組（簡稱F4.0As0.1組）、高氟高砷組（簡稱F4.0As10.0組），分析氟砷聯(lián)合暴露對OB增

4、殖分化的影響。3.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR）法檢測72h氟、砷及氟砷聯(lián)合暴露下細(xì)胞中wnt/β-catenin信號通路中各組分及骨保護(hù)素（Osteoprotegerin， OPG）、破骨細(xì)胞分化因子（Receptor activator of NF-kappaB ligand，RANKL） mRNA表達(dá)；用Westen blot檢測Wnt/β-cat

5、enin信號通路中胞內(nèi)蛋白糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，Gsk-3β）、β連環(huán)蛋白（β-catenin）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2（Runt homology domain transcription factor2，Runx2）、NF-κB1、T-細(xì)胞因子（T-cell factor-1，TCF-1）的變化；采用Elisa法檢測培養(yǎng)液中OPG、RANKL蛋白，Wnt/β-catenin信號通路

6、中胞外蛋白及Wnt3a、Wnt10b、R-spondin1蛋白，胞外拮抗劑Dkk1、Dkk2、骨硬化蛋白（Sclerostin，Sost）、分泌卷曲相關(guān)蛋白（Secreted Frizzled-related proteins，Sfrp1）蛋白的水平。
　　結(jié)果：1.從新生SD大鼠顱蓋骨分離得到的細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后的細(xì)胞經(jīng)鑒定具有典型的OB表型特征，能夠分泌堿性磷酸酶、并能形成礦化結(jié)節(jié)。2.氟離子終濃度0.01~1.0 mmol/

7、L劑量時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和ALP活性，而在氟劑量在>2.0mmol/L時(shí)表現(xiàn)為抑制作用。0.1μmol/L的砷表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖作用而相對抑制分化作用，10.0μmol/L的砷表現(xiàn)為抑制成骨細(xì)胞增殖作用而相對促進(jìn)成骨細(xì)胞分化作用。3.氟砷聯(lián)合暴露對成骨細(xì)胞的影響：3.1氟砷交互作用：As0.1拮抗F0.5的促OB增殖、分化的作用；As10.0與F0.5聯(lián)合作用時(shí)，顯著抑制OB的增殖作用；高氟與低砷或高砷聯(lián)合作用時(shí)，主表現(xiàn)為高氟對O

8、B的損傷作用。3.2氟砷聯(lián)合暴露對成骨細(xì)胞OPG-RANKL系統(tǒng)的影響：F0.5上調(diào)OPG、RANKL、Runx2、NF-κB1 mRNA及蛋白的表達(dá)（P<0.05），上調(diào)OPG/RANKL mRNA及蛋白比值（P<0.05），F(xiàn)4.0下調(diào)OPG、RANKL、Runx2、NF-κB1 mRNA的表達(dá)（P<0.05），對Runx2、NF-κB1蛋白降低明顯（P<0.05），對OPG、RANKL蛋白降低不明顯（P>0.05），下調(diào)OPG/R

9、ANKL mRNA及蛋白比值（P<0.05）；砷單獨(dú)作用下調(diào)RANKL、NF-κB1 mRNA及蛋白的表達(dá)（P<0.05），上調(diào)Runx2 mRNA表達(dá)，但降低Runx2的蛋白水平（P<0.05），對OPG mRNA及蛋白的影響不明顯（P>0.05），As0.1、As10.0拮抗F0.5的作用，降低F0.5As0.1、F0.5As10.0組OPG mRNA及蛋白、RANKL蛋白、Runx2 mRNA蛋白、NF-κB1蛋白的表達(dá)（P<0.

10、05），F(xiàn)4.0拮抗As0.1的作用，降低OPG mRNA的表達(dá)（P<0.05），F(xiàn)0.5組、As10.0相互拮抗，顯著上調(diào)RANKL/OPG蛋白比值（P<0.05），As0.1拮抗F0.5的作用，降低RANKL mRNA的表達(dá)（P<0.05）， As0.1、As10.0拮抗F4.0的作用，降低RANKL蛋白、RANKL/OPG蛋白比值（P<0.05）， F0.5As10.0組、F4.0As0.1組RANKL mRNA的表達(dá)降低明顯（P

11、<0.05），F(xiàn)0.5 As0.1組與F0.5組比較、F0.5As10.0與As10.0比較，上調(diào)RANKL/OPG mRNA比值（P<0.05）， F4.0As0.1，顯著升高NF-κB1蛋白水平,促進(jìn)Runx2 mRNA及蛋白分泌（P<0.05）。3.3氟砷聯(lián)合暴露對成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路的影響：氟、砷對胞內(nèi)核蛋白的影響：F0.5上調(diào)β-catenin mRNA及蛋白的表達(dá)（P<0.05），F(xiàn)4.0對β-cate

12、nin mRNA的表達(dá)影響不明顯，但明顯降低β-catenin蛋白含量（P<0.05），As0.1上調(diào)β-catenin mRNA的表達(dá)明顯（P<0.05），As10.0上調(diào)β-catenin mRNA的表達(dá)不明顯（P>0.05），但均明顯降低β-catenin蛋白水平（P<0.05），氟及砷均下調(diào)Gsk-3βmRNA及蛋白的表達(dá)（P<0.05），氟明顯降低TCF-1蛋白水平（P<0.05）；As0.1、As10.0拮抗F0.5，As0

13、.1拮抗F4.0的作用，上調(diào)Gsk-3βmRNA的表達(dá)，但降低Gsk-3β蛋白的含量（P<0.05），As0.1、As10.0拮抗F0.5，下調(diào)β-catenin mRNA的表達(dá)，但降低β-catenin、TCF-1蛋白的含量（P<0.05），F(xiàn)4.0As0.1組顯著上調(diào)β-catenin、TCF-1蛋白的含量（P<0.05）。氟、砷對胞外配體及激動劑的影響：F0.5上調(diào)Wnt3a、Wnt10b的分泌（P<0.05），降低R-spond

14、in1 mRNA及蛋白的表達(dá)不明顯（P>0.05），F(xiàn)4.0對Wnt3a蛋白的影響不明顯（P>0.05）、顯著降低Wnt10b蛋白及R-spondin1 mRNA及蛋白的表達(dá)（P<0.05）；砷促進(jìn)Wnt3a蛋白的分泌（P<0.05），抑制R-spondin1蛋白的分泌（P<0.05），As0.1明顯降低Wnt10b蛋白的分泌，對R-spondin1 mRNA的表達(dá)作用不明顯（P>0.05），As10.0降低Wnt10b蛋白不明顯（P>

15、0.05），顯著抑制R-spondin1 mRNA的表達(dá)；F0.5As0.1組和F4.0As0.1組的Wnt3a蛋白含量高于相應(yīng)F0.5組、F4.0組（P<0.05），F(xiàn)4.0拮抗As10.0，降低Wnt3a蛋白的分泌（P<0.05），As0.1拮抗F0.5的作用，降低Wnt10b蛋白含量（P<0.05），F(xiàn)0.5As10.0顯著下調(diào)Wnt10b蛋白含量（P<0.05），而F4.0As0.1組、F4.0As10.0組顯著上調(diào)Wnt10b

16、蛋白含量（P<0.05）。氟、砷對胞外抑制劑的影響：F0.5對Dkk1 mRNA及蛋白的表達(dá)改變不明顯（P>0.05），F(xiàn)4.0顯著上調(diào)Dkk1 mRNA的表達(dá)，但對Dkk1蛋白的影響不顯著（P>0.05），砷下調(diào)Dkk1 mRNA的表達(dá)（P<0.05），氟及As10.0均上調(diào)Dkk2 mRNA及蛋白的表達(dá)（P<0.05），F(xiàn)0.5升高Sost蛋白明顯（P<0.05）， F4.0升高Sost蛋白不明顯（P>0.05），砷對Sost蛋白作

17、用不明顯（P>0.05），氟對Sfrp1蛋白水平的影響不明顯（P>0.05），砷顯著降低Sfrp1蛋白水平；F0.5As0.1組的Dkk1 mRNA及蛋白高于As0.1組（P<0.05），F(xiàn)4.0As10.0組下調(diào)Dkk1 mRNA及蛋白含量（P<0.05），F(xiàn)4.0與As0.1相互拮抗Dkk1 mRNA的表達(dá)（P<0.05），F(xiàn)0.5As0.1組顯著上調(diào)Dkk2 mRNA及蛋白含量，F(xiàn)0.5As10.0組Dkk2蛋白高于F0.5，但D

18、kk2 mRNA的表達(dá)低于F0.5組，F(xiàn)4.0As0.1組Dkk2 mRNA及蛋白高于As0.1組， F0.5As0.1組、F4.0As0.1組、F4.0As0.1組、F4As10.0組的Sost蛋白含量均高于對照組，但均低于相應(yīng)單獨(dú)組蛋白水平之和（P<0.05），As0.1、As10.0分別拮抗F0.5、F4.0的作用，降低Sfrp1蛋白的含量（P<0.05）。
　　結(jié)論：1.氟、砷暴露劑量的不同對OB增殖分化作用的影響表現(xiàn)為雙

19、向調(diào)節(jié)作用：F0.5促進(jìn)OB的增殖、分化，下調(diào)RANKL/OPG比值加快骨轉(zhuǎn)換比率，促使骨重建向成骨方向的持續(xù)發(fā)生，F(xiàn)4.0則表現(xiàn)為高氟對OB存活的毒性作用；As0.1刺激OB增殖、抑制OB的分化，As10.0抑制OB的增殖、促進(jìn)OB的分化，主表現(xiàn)為相對降低破骨細(xì)胞的溶骨作用，維持骨穩(wěn)態(tài)的平衡；砷通過拮抗F0.5對成骨細(xì)胞增殖分化作用，并相對上調(diào)RANKL/OPG比值延緩骨重建向成骨方向發(fā)展的速度；As0.1拮抗F4.0的加快骨轉(zhuǎn)換速度