基于Wnt-β-catenin信號通路研究黃精多糖促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化及其作用機制.pdf

1、背景與目的：骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是一種進行性全身性骨代謝性疾病，以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加和易于骨折。目前全世界約2億人患有骨質(zhì)疏松癥，其發(fā)病率已躍居常見病、多發(fā)病的第7位。目前，用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物在一定程度上能減輕骨質(zhì)疏松癥患者的臨床癥狀，提高骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，降低骨折風(fēng)險，但大多數(shù)藥物長期療效不明確，缺乏安全性，長期用藥費用昂貴，患者依從性差。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，黃精的主要活性

2、成分黃精多糖可以抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠模型的骨吸收，改善骨質(zhì)流失，起到防治骨質(zhì)疏松癥的作用，但其作用機制尚未明確。本實驗基于Wnt/β-catenin信號通路探討黃精多糖對體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨分化的促進作用及其可能的作用機制。
　　方法：（1）小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化；（2）MTT法測定不同濃度黃精多糖對BMSCs細胞增殖的影響；（3）在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)下，五個實驗組給予終濃度為5、10、25、

3、50、100mg/L的黃精多糖進行干預(yù)，對照組加等量的無血清培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化；（4）誘導(dǎo)14天后，PNPP法檢測堿性磷酸酶活性；（5）誘導(dǎo)4周后，觀察細胞發(fā)生礦化并進行茜素紅染色，記錄礦化結(jié)節(jié)數(shù)和面積分數(shù)；（6）誘導(dǎo)7、14、21天后，qRT-PCR法檢測成骨相關(guān)基因COLⅠ、ALP、Runx2、OCN mRNA表達；（7）誘導(dǎo)24、48、72h后，采用qRT-PCR方法檢測β-catenin基因表達水平；采用Weste

4、rn Blot分別檢測β-catenin在總蛋白、胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白中的表達水平；（8）以25mg/L黃精多糖處理BMSCs72h，通過免疫熒光檢測β-catenin在細胞內(nèi)的分布；（9）采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測下游β-catenin/TCF的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果：（1）正常BMSCs呈長梭形，成纖維細胞樣，成骨誘導(dǎo)后細胞體積變大，成短梭形；（2）MTT法檢測細胞增殖，各組OD值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；（3）與對照組相比，不

5、同濃度的黃精多糖以劑量依賴性的方式提高堿性磷酸酶活性（P<0.05），25mg/L濃度組最為顯著；（4）礦化結(jié)節(jié)經(jīng)茜素紅染色呈紅色，黃精多糖處理組形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)與礦化面積分數(shù)均顯著高于對照組（P<0.05），但各處理組礦化結(jié)節(jié)數(shù)之間的差異不明顯，礦化面積分數(shù)以劑量依賴性增高；（5）黃精多糖處理能明顯提高成骨相關(guān)基因COLⅠ、ALP、Runx2、OCN mRNA的表達水平（P<0.05）；（6）黃精多糖各濃度組β-catenin mRN

6、A表達水平隨誘導(dǎo)時間的延長而增高，與24h、48h相比，在72h表達量較高，且10、25、50mg/L濃度組顯著高于對照組；（7）濃度在5-50mg/L的黃精多糖處理BMSCs能明顯增加β-catenin的總蛋白量以及在細胞核內(nèi)的蛋白水平，呈現(xiàn)劑量依賴性，在25mg/L達到高峰；β-catenin在細胞質(zhì)中的蛋白水平在各濃度組之間無明顯差異；（8）與對照組相比，25mg/L黃精多糖組胞質(zhì)胞核中均出現(xiàn)了β-catenin的累積，特別是胞核

7、內(nèi)β-catenin積累更加明顯；（9）黃精多糖處理組TOPFlash報告基因的熒光素酶活性顯著增強，其中在25mg/L濃度組增加了3倍，作用最為顯著；FOPFlash報告基因沒有明顯變化。
　　結(jié)論：（1）黃精多糖可促進小鼠骨髓間充干細胞向成骨細胞分化，提示具有潛在的抗骨質(zhì)疏松作用。（2）黃精多糖上調(diào)BMSCsβ-catenin的表達和促進β-catenin核定位，增強β-catenin/TCF的轉(zhuǎn)錄活性。因此，黃精多糖通過激活