Wnt-β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)甲狀旁腺素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 1、通過MC3T3-E1細(xì)胞的傳代及其培養(yǎng)，明確其細(xì)胞形態(tài)變化和生長分化規(guī)律;
　　 2、探討不同濃度和不同給藥方式的甲狀旁腺素(PTH)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的不同影響;
　　 3、明確間歇性PTH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用;
　　 4、明確PTH對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活作用;
　　 5、驗(yàn)證Wnt/β-catenin信號(hào)通路是否具有介導(dǎo)

2、PTH促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用，在細(xì)胞分子水平闡明PTH的作用機(jī)制，為臨床骨質(zhì)疏松癥和骨折愈合的治療提供新思路和重要依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng):傳代培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，以2.5×105/孔的細(xì)胞濃度種植于6孔板內(nèi)，細(xì)胞生長于α-MEM培養(yǎng)液中，內(nèi)加10％胎牛血清、1％青霉素/慶大霉素溶液、5mM L-Glutamine，置于37℃、5％ CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，至細(xì)胞70％-80％融合時(shí)，開始以

3、不同濃度和給藥方式的PTH處理細(xì)胞。
　　 2、PTH處理和細(xì)胞分組:對(duì)于間歇性給藥，每日以PTH處理細(xì)胞6h，每48h為1個(gè)循環(huán)，每2d收集細(xì)胞，進(jìn)行成骨因子基因檢測。對(duì)于持續(xù)性給藥，每日以PTH處理細(xì)胞24h，每24h為1個(gè)循環(huán)，每2d收集細(xì)胞，進(jìn)行成骨因子基因檢測。并根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)的不同，將細(xì)胞分為不同實(shí)驗(yàn)組:鹽水對(duì)照組、PTH組、β-cateninsiRNA組和β-catenin siRNA+PTH組。
　　 3、

4、轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn):Topflash firefy熒光素酶質(zhì)粒(500ng/well)和SV-40 Renilla(20ng/well)熒光素酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以雙熒光素酶報(bào)告基因檢測方法，檢測Topflash熒光素酶的活性。應(yīng)用β-catenin siRNA寡核苷酸，孵育細(xì)胞36小時(shí)，然后以PTH處理6天，進(jìn)行相應(yīng)RNA、蛋白及堿性磷酸酶(ALP)染色實(shí)驗(yàn)。
　　 4、Real-time PCR實(shí)驗(yàn):用RNeasy試劑盒提取細(xì)胞總RNA

5、，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后稀釋3倍，取1μl稀釋后的cDNA進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)，以檢測成骨因子mRNA的表達(dá)。在同一次反應(yīng)中，各組均設(shè)3個(gè)平行重復(fù)。以β-actin為內(nèi)參基因，通過RotorGene分析軟件進(jìn)行定量分析。
　　 5、堿性磷酸酶染色:于室溫以10％中性福爾馬林固定細(xì)胞30min;吸除福爾馬林，PBS清洗2次，加入ALP one-step染色劑，于37℃孵育45min，進(jìn)行ALP染色

6、檢查，以檢測細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性。
　　 6、Alizarin Red染色:于4℃以10％中性福爾馬林固定細(xì)胞20min;吸除福爾馬林，蒸餾水清洗3次，加入Alizarin Red染色劑，于室溫下染色30min，進(jìn)行Alizarin Red染色檢查，以檢測細(xì)胞內(nèi)成骨鈣化的作用。
　　 7、免疫熒光檢測:于室溫下以4％中性福爾馬林固定細(xì)胞15min，0.1％TritonX-100通透細(xì)胞膜，0.05％ Tween20清洗

7、細(xì)胞3次，2.5％BSA封閉60min，分別加入一抗和二抗后，固定，進(jìn)行免疫熒光檢測。
　　 8、Westernblot實(shí)驗(yàn):以Golden lysis buffer液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每泳道上樣40μg，經(jīng)10％聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，加入一抗和二抗后，顯影照相，以β-actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，以檢測細(xì)胞內(nèi)成骨因子蛋白的表達(dá)。
　　 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:全部數(shù)據(jù)

8、以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)1日后即出現(xiàn)細(xì)胞貼壁現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)量較少，形態(tài)不規(guī)則;培養(yǎng)3日細(xì)胞數(shù)量略有增加，但形態(tài)仍不規(guī)則;培養(yǎng)5日細(xì)胞數(shù)量明顯增加，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L梭形，可見少量細(xì)胞融合;培養(yǎng)7日細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)明顯增加，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L橢圓形，達(dá)到70％-80％細(xì)胞融合;
　

9、　 2、MC3T3-E1細(xì)胞隨時(shí)間增長其細(xì)胞內(nèi)ALP、OC、Bsp和Runx2等成骨因子mRNA的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，堿性磷酸酶染色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng);
　　 3、經(jīng)間歇性1nM濃度的PTH和10nM濃度的PTH處理后，MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ALP、OC、Bsp和Runx2等各個(gè)成骨因子mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，堿性磷酸酶染色和Alizarin Red染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，以10nM濃度的PTH效果更明顯;100nM濃度的PTH

10、處理后，MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ALP、OC、Bsp和Runx2等各個(gè)成骨因子mRNA的表達(dá)沒有明顯增強(qiáng)(P＞0.05);堿性磷酸酶染色和Alizarin Red染色強(qiáng)度也沒有增強(qiáng);
　　 4、持續(xù)性10nM濃度的PTH處理后，MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ALP、OC、Bsp、Osx、Col1a1和Runx2等各個(gè)成骨因子mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.05);堿性磷酸酶染色和Alizarin Red染色強(qiáng)度也明顯降低;免疫熒光檢測顯示

11、Osx蛋白的表達(dá)明顯降低;OC、Bsp、Col1a1和Runx2等成骨因子蛋白的表達(dá)也明顯降低;
　　 5、經(jīng)間歇PTH處理后，MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ALP、OC、Bsp和Runx2等各個(gè)成骨因子mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)，于處理第6日時(shí)達(dá)到峰值;經(jīng)間斷PTH處理后，堿性磷酸酶的活性也顯著增強(qiáng)(P＜0.05);
　　 6、PTH顯著增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)β-catenin mRNA和蛋白的表達(dá)，經(jīng)PTH處理后細(xì)胞內(nèi)

12、Topflash熒光素酶的活性顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，PTH對(duì)Wnt信號(hào)通路具有明顯的激活作用;
　　 7、經(jīng)β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后，MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)受到明顯抑制，雖經(jīng)PTH再次處理后，抑制作用沒有明顯逆轉(zhuǎn)，表明siRNA轉(zhuǎn)染已經(jīng)成功;
　　 8、經(jīng)β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后，MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ALP、OC、Bsp和Runx2等各個(gè)成骨因子mRNA和蛋白的表

13、達(dá)顯著降低，且經(jīng)PTH處理后，此種作用未得到逆轉(zhuǎn);堿性磷酸酶染色強(qiáng)度也于β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后顯著降低，且經(jīng)PTH處理后無逆轉(zhuǎn)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、MC3T3-E1細(xì)胞有自發(fā)向成骨細(xì)胞方向分化的趨勢;
　　 2、PTH的作用具有劑量依賴性，10nM濃度的PTH具有最大作用效果;
　　 3、持續(xù)性給與PTH抑制MC3T3-E1向成骨細(xì)胞方向分化，而間斷給與PTH則可以明顯

14、促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，此種作用于PTH處理后第6日時(shí)達(dá)到峰值;
　　 4、PTH顯著增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)β-catenin mRNA和蛋白的表達(dá)，并顯著提高Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性;
　　 5、經(jīng)β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后，MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)β-catenin基因功能出現(xiàn)沉默作用，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性受到抑制作用，且此種抑制作用不能為PTH逆轉(zhuǎn)