Wnt-β-catenin信號通路介導甲狀旁腺素促進成骨細胞分化的實驗研究.pdf

1、實驗目的：
　　 1、通過MC3T3-E1細胞的傳代及其培養(yǎng)，明確其細胞形態(tài)變化和生長分化規(guī)律;
　　 2、探討不同濃度和不同給藥方式的甲狀旁腺素(PTH)對MC3T3-E1細胞成骨分化的不同影響;
　　 3、明確間歇性PTH對MC3T3-E1細胞成骨分化的促進作用;
　　 4、明確PTH對Wnt/β-catenin信號通路的激活作用;
　　 5、驗證Wnt/β-catenin信號通路是否具有介導

2、PTH促進成骨細胞分化的作用，在細胞分子水平闡明PTH的作用機制，為臨床骨質疏松癥和骨折愈合的治療提供新思路和重要依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 1、細胞培養(yǎng):傳代培養(yǎng)MC3T3-E1細胞，以2.5×105/孔的細胞濃度種植于6孔板內，細胞生長于α-MEM培養(yǎng)液中，內加10％胎牛血清、1％青霉素/慶大霉素溶液、5mM L-Glutamine，置于37℃、5％ CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，至細胞70％-80％融合時，開始以

3、不同濃度和給藥方式的PTH處理細胞。
　　 2、PTH處理和細胞分組:對于間歇性給藥，每日以PTH處理細胞6h，每48h為1個循環(huán)，每2d收集細胞，進行成骨因子基因檢測。對于持續(xù)性給藥，每日以PTH處理細胞24h，每24h為1個循環(huán)，每2d收集細胞，進行成骨因子基因檢測。并根據(jù)各個實驗的不同，將細胞分為不同實驗組:鹽水對照組、PTH組、β-cateninsiRNA組和β-catenin siRNA+PTH組。
　　 3、

4、轉染實驗:Topflash firefy熒光素酶質粒(500ng/well)和SV-40 Renilla(20ng/well)熒光素酶質粒共轉染細胞，以雙熒光素酶報告基因檢測方法，檢測Topflash熒光素酶的活性。應用β-catenin siRNA寡核苷酸，孵育細胞36小時，然后以PTH處理6天，進行相應RNA、蛋白及堿性磷酸酶(ALP)染色實驗。
　　 4、Real-time PCR實驗:用RNeasy試劑盒提取細胞總RNA

5、，按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，然后稀釋3倍，取1μl稀釋后的cDNA進行Real-timePCR反應，以檢測成骨因子mRNA的表達。在同一次反應中，各組均設3個平行重復。以β-actin為內參基因，通過RotorGene分析軟件進行定量分析。
　　 5、堿性磷酸酶染色:于室溫以10％中性福爾馬林固定細胞30min;吸除福爾馬林，PBS清洗2次，加入ALP one-step染色劑，于37℃孵育45min，進行ALP染色

6、檢查，以檢測細胞內堿性磷酸酶的活性。
　　 6、Alizarin Red染色:于4℃以10％中性福爾馬林固定細胞20min;吸除福爾馬林，蒸餾水清洗3次，加入Alizarin Red染色劑，于室溫下染色30min，進行Alizarin Red染色檢查，以檢測細胞內成骨鈣化的作用。
　　 7、免疫熒光檢測:于室溫下以4％中性福爾馬林固定細胞15min，0.1％TritonX-100通透細胞膜，0.05％ Tween20清洗

7、細胞3次，2.5％BSA封閉60min，分別加入一抗和二抗后，固定，進行免疫熒光檢測。
　　 8、Westernblot實驗:以Golden lysis buffer液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每泳道上樣40μg，經10％聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白，轉膜，加入一抗和二抗后，顯影照相，以β-actin為內參基因，進行Western Blot實驗，以檢測細胞內成骨因子蛋白的表達。
　　 9、統(tǒng)計學分析:全部數(shù)據(jù)

8、以均數(shù)±標準差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用t檢驗，當P＜0.05時認為有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果：
　　 1、MC3T3-E1細胞經傳代培養(yǎng)1日后即出現(xiàn)細胞貼壁現(xiàn)象，細胞數(shù)量較少，形態(tài)不規(guī)則;培養(yǎng)3日細胞數(shù)量略有增加，但形態(tài)仍不規(guī)則;培養(yǎng)5日細胞數(shù)量明顯增加，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L梭形，可見少量細胞融合;培養(yǎng)7日細胞數(shù)量繼續(xù)明顯增加，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L橢圓形，達到70％-80％細胞融合;
　

9、　 2、MC3T3-E1細胞隨時間增長其細胞內ALP、OC、Bsp和Runx2等成骨因子mRNA的表達逐漸增強，堿性磷酸酶染色強度逐漸增強;
　　 3、經間歇性1nM濃度的PTH和10nM濃度的PTH處理后，MC3T3-E1細胞內ALP、OC、Bsp和Runx2等各個成骨因子mRNA的表達顯著增強(P＜0.05)，堿性磷酸酶染色和Alizarin Red染色強度明顯增強，以10nM濃度的PTH效果更明顯;100nM濃度的PTH

10、處理后，MC3T3-E1細胞內ALP、OC、Bsp和Runx2等各個成骨因子mRNA的表達沒有明顯增強(P＞0.05);堿性磷酸酶染色和Alizarin Red染色強度也沒有增強;
　　 4、持續(xù)性10nM濃度的PTH處理后，MC3T3-E1細胞內ALP、OC、Bsp、Osx、Col1a1和Runx2等各個成骨因子mRNA的表達顯著降低(P＜0.05);堿性磷酸酶染色和Alizarin Red染色強度也明顯降低;免疫熒光檢測顯示

11、Osx蛋白的表達明顯降低;OC、Bsp、Col1a1和Runx2等成骨因子蛋白的表達也明顯降低;
　　 5、經間歇PTH處理后，MC3T3-E1細胞內ALP、OC、Bsp和Runx2等各個成骨因子mRNA和蛋白的表達顯著增強，于處理第6日時達到峰值;經間斷PTH處理后，堿性磷酸酶的活性也顯著增強(P＜0.05);
　　 6、PTH顯著增強MC3T3-E1細胞內β-catenin mRNA和蛋白的表達，經PTH處理后細胞內

12、Topflash熒光素酶的活性顯著增強(P＜0.05)，PTH對Wnt信號通路具有明顯的激活作用;
　　 7、經β-catenin siRNA轉染后，MC3T3-E1細胞內β-catenin蛋白的表達受到明顯抑制，雖經PTH再次處理后，抑制作用沒有明顯逆轉，表明siRNA轉染已經成功;
　　 8、經β-catenin siRNA轉染后，MC3T3-E1細胞內ALP、OC、Bsp和Runx2等各個成骨因子mRNA和蛋白的表

13、達顯著降低，且經PTH處理后，此種作用未得到逆轉;堿性磷酸酶染色強度也于β-catenin siRNA轉染后顯著降低，且經PTH處理后無逆轉(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1、MC3T3-E1細胞有自發(fā)向成骨細胞方向分化的趨勢;
　　 2、PTH的作用具有劑量依賴性，10nM濃度的PTH具有最大作用效果;
　　 3、持續(xù)性給與PTH抑制MC3T3-E1向成骨細胞方向分化，而間斷給與PTH則可以明顯

14、促進MC3T3-E1細胞向成骨細胞方向分化，此種作用于PTH處理后第6日時達到峰值;
　　 4、PTH顯著增強MC3T3-E1細胞內β-catenin mRNA和蛋白的表達，并顯著提高Wnt/β-catenin信號通路的活性;
　　 5、經β-catenin siRNA轉染后，MC3T3-E1細胞內β-catenin基因功能出現(xiàn)沉默作用，Wnt/β-catenin信號通路的活性受到抑制作用，且此種抑制作用不能為PTH逆轉