二甲雙胍對(duì)成骨細(xì)胞及去卵巢大鼠OPG-RANKL表達(dá)的影響.pdf

1、背景:糖尿病是21世紀(jì)最嚴(yán)重,最具挑戰(zhàn)性的疾病之一,影響了世界上數(shù)百萬人。最近,糖尿病與骨質(zhì)疏松性骨折的關(guān)系越來越被人重視[1]。大量臨床試驗(yàn)報(bào)道證實(shí)骨質(zhì)疏松是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一[2-4]。正因1型糖尿病及2型糖尿病患者所引起的骨折風(fēng)險(xiǎn)比非糖尿病大[5,6],并且糖尿病及骨質(zhì)疏松均主要作用于中老年患者,給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,如何防止糖尿病所致的骨折是目前迫不及待的一項(xiàng)重要任務(wù)。
　　 二甲雙胍是目前國(guó)外唯一應(yīng)用并被

2、FDA認(rèn)可的雙胍類降糖藥,在臨床中有著廣泛的應(yīng)用。近來,一項(xiàng)回顧性研究結(jié)果表明二甲雙胍能減少1型和2型糖尿病患者骨折的發(fā)生率[7,8]。Cortizo等研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞系(UMR106,MC3T3)的生長(zhǎng)和分化,同時(shí)具有增加細(xì)胞外基質(zhì)礦化的能力[9]。正因二甲雙胍能減少骨折的發(fā)生率并對(duì)成骨細(xì)胞起著積極的作用,這表明二甲雙胍能明顯減少骨丟失[10,11]。但是二甲雙胍如何減少骨丟失的機(jī)制是復(fù)雜的,而且目前其機(jī)制并不清楚,

3、對(duì)于二甲雙胍對(duì)破骨細(xì)胞的影響至今仍未見報(bào)道。
　　 骨組織的穩(wěn)定主要是由于骨吸收及骨形成的相互平衡。起骨吸收作用的主要細(xì)胞是破骨細(xì)胞。很早以前就有報(bào)道,破骨細(xì)胞主要來源于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng),由單核細(xì)胞融合分化而成。其分化和成熟主要靠集落刺激因子(M-CSF),護(hù)骨素(OPG)及護(hù)骨素配體(RANKL)。
　　 成骨細(xì)胞分泌的兩種細(xì)胞因子對(duì)骨重建起著重要的作用,這兩種細(xì)胞因子就是OPG及RANKL[12,13]。OPG及RA

4、NKL有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的作用,RANKL通過與表達(dá)于破骨細(xì)胞的細(xì)胞核因子-κB受體活化因子(RANK)結(jié)合,能夠刺激破骨細(xì)胞活化和增殖；OPG與RANKL競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RANK,從而抑制骨吸收,防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生[14,15]。因此,RANKL/RANK/OPG軸的失衡是導(dǎo)致很多溶骨性骨異常吸收疾病的主要原因。
　　 目的:綜上所述,二甲雙胍和OPG/RANKL比率在骨修復(fù)重建中都起著重要的作用。但二甲雙胍能對(duì)成骨細(xì)胞OPG及RANKL

5、分泌的影響及分子機(jī)制尚未見報(bào)道。本文通過細(xì)胞與動(dòng)物模型,探討了二甲雙胍對(duì)成骨細(xì)胞及去卵巢大鼠OPG/RANKL表達(dá)的影響,為二甲雙胍臨床防治糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的合理用藥提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:本研究旨在通過分子、細(xì)胞及整體水平深入探討二甲雙胍依賴OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成及其相關(guān)的作用機(jī)制的初步研究。用RT-PCR,ELISA和Western blotting等生物學(xué)技術(shù),從基因及蛋白表達(dá)水平,

6、研究在二甲雙胍誘導(dǎo)下成骨細(xì)胞OPG/RANKL表達(dá)變化情況,闡明其相應(yīng)的分子生物學(xué)基礎(chǔ),并對(duì)其相關(guān)的分子作用機(jī)制進(jìn)行初步探討以及應(yīng)用成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞前體(Raw264.7細(xì)胞)共培養(yǎng)模型進(jìn)一步驗(yàn)證以上結(jié)論。同時(shí),對(duì)去卵巢誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠給予二甲雙胍干預(yù)下,檢測(cè)OPG/RANKL的表達(dá)并運(yùn)用骨密度、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)、破骨細(xì)胞染色計(jì)數(shù)等手段來綜合評(píng)價(jià)二甲雙胍對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的防治作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.二甲雙胍

7、對(duì)成骨細(xì)胞OPG/RANKL mRNA和蛋白表達(dá)的影響
　　 A.二甲雙胍對(duì)頭蓋骨成骨細(xì)胞及MC3T3-E1呈濃度及時(shí)間依賴性增加OPGmRNA水平的表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,不同濃度二甲雙胍(200-800μmol/L)分別作用于成骨細(xì)胞48h,均可呈劑量依賴性促進(jìn)頭蓋骨成骨細(xì)胞OPG mRNA的表達(dá)(P<0.05)。200μmol/L時(shí)約為對(duì)照組表達(dá)量的1.31倍,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.05),400

8、或800μmol/L時(shí)約為對(duì)照組表達(dá)量的1.63及1.75倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),這結(jié)果與陽性對(duì)照雌激素結(jié)果相似。同時(shí),400μmol/L二甲雙胍干預(yù)成骨細(xì)胞24-72h后發(fā)現(xiàn)二甲雙胍呈時(shí)間依賴性促進(jìn)OPG mRNA的表達(dá),差異均有顯著意義(P<0.05)。400μmol/L二甲雙胍作用于成骨細(xì)胞72 h促進(jìn)作用最明顯,約為對(duì)照組表達(dá)水平的2.03倍,有顯著性差異(P=0.000)。
　　 B.二甲雙胍對(duì)成骨細(xì)胞

9、OPG上調(diào)的機(jī)制可能與AMPK通路有關(guān)ELISA結(jié)果顯示:隨著二甲雙胍濃度的增加,OPG表達(dá)水平呈劑量依賴性增高。各種不同藥物濃度(50—800μmol/L)作用頭蓋骨成骨細(xì)胞48h后OPG蛋白表達(dá)差異均有顯著意義(P<0.001),50μmol/L時(shí)OPG蛋白的表達(dá)即開始升高,200-800μmol/L時(shí)OPG增加比較明顯(P<0.001),800μmol/L時(shí)OPG蛋白的表達(dá)最高。為明確二甲雙胍上調(diào)成骨細(xì)胞OPG的作用機(jī)制,本研究使

10、用了各種不同抑制劑。結(jié)果示AMPK以及CaMKK特異抑制劑compound C和STO-609,而非MEK1、p38、NF-κB特異抑制劑PD98059、SB203580、Bay-117028降低二甲雙胍對(duì)成骨細(xì)胞OPG上調(diào)作用。
　　 C.二甲雙胍減少成骨細(xì)胞RANKL mRNA和蛋白的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍呈劑量依賴性減少頭蓋骨成骨細(xì)胞RANKL mRNA水平的表達(dá)。Western blot結(jié)果同樣示二甲雙胍呈劑量依賴性減

11、少RANKL表達(dá)。
　　 D.二甲雙胍能抑制破骨細(xì)胞分化。本研究使用二甲雙胍與維生素D3共同作用成骨細(xì)胞的上清液誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞分化并進(jìn)行TRAP染色計(jì)數(shù)。結(jié)果示隨著二甲雙胍濃度的增加,破骨細(xì)胞呈劑量依賴性減少。為明確破骨細(xì)胞的存在,本研究進(jìn)一步行RT—PCR檢測(cè)對(duì)照組不同時(shí)間段破骨細(xì)胞特異基因TRAP和cathepsin K表達(dá),結(jié)果示上述基因表達(dá)隨時(shí)間的增加而增加。由此可知,二甲雙胍是通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌而

12、抑制破骨細(xì)胞分化。
　　 2.二甲雙胍對(duì)去卵巢大鼠OPG/RANKL表達(dá)的影響及對(duì)骨質(zhì)疏松防治作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 A.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí),二甲雙胍能上調(diào)去卵巢大鼠OPG、下調(diào)RANKL表達(dá)的影響。ELISA結(jié)果示二甲雙胍能增加去卵巢大鼠血清OPG的表達(dá)；Western blot結(jié)果示二甲雙胍能下調(diào)去卵巢大鼠骨髓組織中RANKL的表達(dá)。
　　 B.二甲雙胍能抑制破骨細(xì)胞形成及骨丟失。
　　 骨密度檢測(cè):OVX

13、組低于Sham組(P<0.001),而OVX-+Met組明顯高于OVX組(P<0.001),Sham組與OVX+Met組結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 骨切片Von Kossa及TRAP染色:Von Kossa染色示OVX+Met組的礦化結(jié)節(jié)明顯多于OVX組,二甲雙胍能防止OVX的骨丟失。TRAP染色示OVX組破骨細(xì)胞數(shù)約為Sham組的8.15倍,但二甲雙胍能明顯減少OVX組的破骨細(xì)胞數(shù)。
　　 結(jié)論:通過細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,