山葡萄花色苷生物合成相關結構基因克隆與表達.pdf

1、山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)是我國重要的野生果樹資源?；ㄉ帐巧狡咸压麑嵵兄饕亩喾宇惔紊x產物,與山葡萄的抗病性、色澤、風味等密切相關?；ㄉ詹粌H影響植物源食品的感官和營養(yǎng)價值,還具有多種醫(yī)藥方面的生理活性。本文進行了山葡萄轉色期果皮eDNA文庫的構建,對山葡萄花色苷生物合成相關結構基因進行了克隆和序列分析,對山葡萄果實不同成熟期,不同組織與器官中花色苷合成的相關基因表達進行了初步研究。主要研究結果如下:

2、r>　　 通過三種提取方法提取山葡萄果皮和葉片中的總RNA,其中改良CTAB法能分離出高質量的RNA,可用于下一步的分子生物學研究。以轉色期(50％著色)山葡萄果皮為材料,提取總RNA合成cDNA,連接到質粒載體pDNR-LIB上,采用電穿孔法將重組質粒轉化到DH5α中,成功構建了山葡萄果皮cDNA文庫。文庫質量鑒定表明,原始文庫滴度為1.12×106pfu·mL-1,擴增后的文庫滴度為2.82×109 pfu·mL-1,重組率接近1

3、00％,插入片段大小范圍在0.5～2kb之間,平均約為0.80 kb,表明應用SMARTTM技術已成功構建了山葡萄轉色期果皮cDNA文庫。
　　 山葡萄轉色期果皮cDNA文庫測序獲得974條有效EST序列。GenBank登錄號:GW666520～GW667493。974條EST拼接后代表了710個Unigenes。BLAST注釋結果表明,具有已知或推測功能基因270個,未知功能基因258個,未比對上的基因182個(可能是新基因)

4、。根據BLASTX注釋與GO分類,199條EST序列具有細胞組件功能,313條EST序列在分子功能上得到注釋,341條EST序列在生物學途徑上得到注釋。
　　 采用RT-PCR、SMARTTM RACE技術從山葡萄成熟期果皮中克隆到了類黃酮-3'-羥化酶(VAmF3'H)、類黃酮-3,5'-羥化酶(VAmF3'5'H)、黃烷酮醇4-還原酶(VAmDFR)、無色花色素雙加氧酶(VAmLDOX)、類黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶(VAm

5、3GT),O-甲基轉移酶(VAmOMT),谷胱甘肽轉移酶(VAmGST4)和類黃酮5-O-葡萄糖基轉移酶(VAmOGT)等8個基因的cDNA全長序列。GenBank登錄號為:FJ645766、FJ645767、FJ645768、FJ645769、FJl69463、GU237132、FJ645770和GU237133。利用生物信息學分析,推測8個基因分別編碼509、508、337、355、456、235、213和448個氨基酸的多肽,分子

6、量為56.14、56.70、37.50、40.19、50.19、26.35、24.24和49.84 kDa。與其它物種相關基因的氨基酸序列進行了多重比較,各基因與歐亞種葡萄(Vitis vinfera L.)相關基因的相似性均超過90％。在此基礎上構建了這8個基因與其它物種相應基因的分子進化樹,分析了與其它物種相關基因的親緣關系。各基因信號肽預測結果表明,8個基因都不具有信號肽結構,對各基因分別進行了疏水性分析,初步預測了其二級結構。<

7、br>　　 對山葡萄幼葉、成熟葉、莖、果肉和果皮中花色苷生物合成結構基因的表達進行了初步研究。半定量RT-PCR分析結果表明,VAmF3'H和VAmF3'5'H在花后各個時期的果皮中均有表達,轉色期上調表達;VAmDFR、VAmLDOX和VAmOGTG在花后各個時期的果皮中均有表達,各個時期的表達強度差異不明顯;VAm3GT和VAmGST4在果實轉色期前基本不表達,轉色期為上調表達;VAmOMT在花后兩周有少量表達,隨后表達量下降,轉

8、色期開始上調表達。VAmF3'H、VAmF3'5'H,VAmDFR、VAmLDOX和VAmOGT在各個組織與器官中均有表達,但VAmF3'5'H在成熟葉中的表達量很少;VAm3GT、VAmOMT和VAmGST4在葉片中都不表達,在莖、果肉、果皮中都有表達,VAmOMT在果肉中表達豐度低。Northern雜交結果表明,VAm3GT在果實轉色期前基本不表達,轉色期上調表達;VAmOGT在果實成熟過程中均有表達。
　　 用DNA重組技