紫蘇迷迭香酸合成酶基因克隆與表達分析研究.pdf

1、本研究以唇形科植物紫蘇(Perillafrutescens)做為研究對象，采用cDNA末端快速擴增(RapidamplificationofcDNAends，RACE)技術，首次從紫蘇中克隆到迷迭香酸生物合成途徑中的迷迭香酸合成酶(Rosmarinicacidsynthase，RAS)基因(命名為PerRAS)全長cDNA序列（GenBank登錄號:KC355369），并對其進行了生物信息學分析和表達譜研究。
　　通過對已報道的唇

2、形科植物丹參（Salviamiltiorrhiza）、彩葉草（Solenoatemonscutellarioides）、香蜂草（Melissaofficinalis）等的RAS基因比對，分析保守序列并設計引物，采用RACE技術克隆到1516bp的cDNA全長，包含1299bp的開放閱讀框(ORF)，編碼432個氨基酸，72bp的5'非編碼區(qū)(5'UTR)和145bp的3'非編碼區(qū)(3'UTR)。BLAST比對顯示該基因與已報道的RAS基

3、因具有很高的相似性，其ORF序列與香蜂草、丹參和彩葉草的相似度分別為89.76％、87.67％和87.45％，與薰衣草（Lavandulaangustifolia）的ORF序列相似度為79.73％;氨基酸序列與丹參、彩葉草、香蜂草和薰衣草的總相似度為84.13％。
　　用生物信息學軟件對所克隆到的紫蘇PerRAS基因進行序列分析。結果表明，其編碼的氨基酸親水性分析表現(xiàn)為疏水性;信號肽研究結果表明其不存在信號肽酶切位點，不具有信號肽

4、。同時，跨膜結構域預測結果顯示其不具有跨膜結構域。對紫蘇RAS蛋白前體的二級結構預測顯示，其含有19.68％的α螺旋、24.30％的延伸鏈和56.02％的隨機卷曲;進一步對其高級結構進行預測，得到了紫蘇RAS蛋白的三維模型。RAS系統(tǒng)進化樹分析結果表明，各RAS基因編碼的蛋白均有明顯的種屬特性，紫蘇RAS與唇形科植物RAS親緣關系最近，且RAS基因早在被子植物和裸子植物中就已經(jīng)存在，是一個古老的基因。
　　以紫蘇β-Actin基因

5、作內標，采用熒光實時定量PCR對PerRAS基因的表達譜進行分析，結果表明PerRAS基因在根中的表達豐度最高，莖中最低，推斷紫蘇迷迭香酸（Rosemaryacid，RA）的合成途徑中RAS在根中起主要的催化作用;30min的UV-B照射、200μmol/LH2O2分別在一定程度上下調PerRAS基因的轉錄表達水平，推測PerRAS可能參與紫蘇對氧化脅迫的應激反應;500μmol/LMeJA一定程度的上調PerRAS基因的轉錄表達水平。