慢性HBV感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)和乙肝慢性化關(guān)系.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒(HBV)非常容易造成感染的慢性化，但是其慢性化的發(fā)病機(jī)制目前還沒(méi)有完全研究清楚。近幾年來(lái)的研究成果表明，外周血淋巴細(xì)胞的凋亡和免疫耐受的發(fā)生與HBV感染的慢性化有密切的關(guān)系。活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD)是指已經(jīng)激活的成熟淋巴細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞）在抗原呈遞細(xì)胞和細(xì)胞因子如IL-1、IL-2的輔助作用下被抗原性物質(zhì)或其他因素活化后，當(dāng)再一次受到激活信號(hào)（尤其是T細(xì)胞受體/CD3復(fù)合物等）刺激后分泌TNF等細(xì)胞

2、因子或通過(guò)表達(dá)FasL等膜蛋白從而誘導(dǎo)自身所發(fā)生的細(xì)胞凋亡。外周血淋巴細(xì)胞通過(guò)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，不僅可以維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)，也可能是導(dǎo)致機(jī)體外周免疫耐受形成的重要因素。外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)即外周血中具有單個(gè)細(xì)胞核的細(xì)胞，主要由大量的淋巴細(xì)胞組成，除此之外還包括少量的自然殺傷細(xì)胞(NK)、單核巨噬細(xì)胞等各種免疫活性細(xì)胞，在機(jī)體對(duì)抗外來(lái)抗原的免疫反應(yīng)尤其是特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)中起重要作用。
　　細(xì)胞凋亡是機(jī)體為了維持內(nèi)環(huán)境的

3、穩(wěn)態(tài)，在各種細(xì)胞因子的共同參與和凋亡相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控下，發(fā)生的一系列有步驟的裂解過(guò)程，是一種生理性的細(xì)胞死亡。細(xì)胞的凋亡路徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的確切發(fā)生機(jī)制到目前為止還沒(méi)有完全搞清楚。根據(jù)起始激活的Caspase家族成員不同，細(xì)胞凋亡的激活途徑可以分為三種:第一種是死亡受體途徑，又稱為外源性途徑，通過(guò)FAS配體(FASLG)與FAS(CD95)的結(jié)合而觸發(fā)凋亡。FAS-FASL結(jié)合以后，通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡蛋白酶8(CASP

4、8)的激活，隨后活化的凋亡蛋白酶8又可以進(jìn)一步激活凋亡效應(yīng)器即凋亡蛋白酶3，凋亡蛋白酶6，凋亡蛋白酶7(CASP3，CASP6，CASP7)，由凋亡效應(yīng)器執(zhí)行下面的凋亡過(guò)程。第二種是線粒體途徑，又稱為內(nèi)源性途徑，在凋亡信號(hào)的刺激下，原本儲(chǔ)存在線粒體膜間隙的凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、細(xì)胞色素C(CytC)等釋放出來(lái)到胞漿中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在ATP/dATP存在的前提條件下，位于膜間隙中的大量CytC釋放處理進(jìn)入到胞漿，然后與Apaf-1形成多

5、聚復(fù)合體，通過(guò)Apaf-1 N-末端的Caspase-募集結(jié)構(gòu)域(CARD)招募聚集胞質(zhì)中的caspase-9，并誘導(dǎo)其活化進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。第三種是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，在應(yīng)激狀態(tài)下促使caspase-7由胞漿轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)caspase-12的表達(dá)增加。由Caspase-7進(jìn)一步激活caspase-12，而后者激活后又可進(jìn)一步剪切加工caspase3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。
　　本次研究的目的在于探討慢性HBV感染者P

6、BMC中是否存在AICD現(xiàn)象，外周血淋巴細(xì)胞不同的凋亡路徑，及其在HBV感染慢性化過(guò)程中作用。
　　方法：1.入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn):慢性HBV攜帶者9名，慢性乙型肝炎患者48名（其中輕度患者14例，中度患者22例，重度患者12例），肝硬化患者24名，所有入選患者的診斷符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除甲、丙、丁和戊型肝炎及其他原因所致的肝損害。20例健康人為正常對(duì)照組。
　　2.標(biāo)本采集:嚴(yán)格按照無(wú)菌操作

7、的原則，采集空腹靜脈血7ml，加入EDTA抗凝。其中3ml離心(2000r/min，5min)獲得血漿，-80℃保存?zhèn)溆谩?ml新鮮全血用Ficoll密度梯度離心法提取PBMC，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　3.提取總RNA,測(cè)定RNA濃度和純度取出凍存的PBMC，室溫條件下解凍5min，然后加入1ml Trizol，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書規(guī)范操作，提取總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度，保證A260/A280在1.8～2.0。
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8、.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PBMC中FAS，CASP-8，CYCS，CASP-9，CASP-3的表達(dá)。
　　5.采用“雙抗體一步夾心法”酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血漿中CASP-8，CASP-9，CASP-3的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:CHB組和ASC組凋亡相關(guān)基因（FAS，Caspase-8，CYCS，Caspase-9，Caspase-3）的表達(dá)明顯高于NC組和LC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

9、＜0.05)，LC組高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而CHB組和ASC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.ELISA結(jié)果顯示:血漿Caspase-9，Caspase-8，Caspase-3濃度由高到低依次為CHB組和ASC組＞LC組＞NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0083)，CHB組和ASC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.0083)。
　　3.ELISA結(jié)果顯示:HBV-DNA陽(yáng)性組血漿Caspase

10、-9，Caspase-8，Caspase-3的濃度均明顯高于HBV-DNA陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.ELISA結(jié)果顯示:血漿Caspase-9，Caspase-8，Caspase-3濃度水平由高到低依次為:慢性乙肝（輕度）組＞慢性乙肝（中度）組＞慢性乙肝（重度）組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論：HBV感染可以誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞的凋亡(即AICD)，內(nèi)源性路徑（即線粒體途徑）和外源