Toll樣受體-3和-4對干細(xì)胞成軟骨分化的影響及機(jī)制.pdf

1、目的:探索Toll樣受體（Toll Like Receptor，TLR）-3和-4在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）成軟骨分化的過程中對蛋白多糖和II型膠原蛋白形成的影響及機(jī)制。
　　方法:用Ficoll密度梯度離心法分離SD大鼠BMSCs，并進(jìn)行傳代擴(kuò)增。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD44、CD54、CD90的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。取活力好的第3代BMS

2、Cs作為實(shí)驗(yàn)對象，在正式分組干預(yù)前，首先以Western blot法檢測蛋白多糖和II型膠原的表達(dá)，作為后續(xù)試驗(yàn)的比較基線。再將BMSCs隨機(jī)分為空白組、TLR-3激活組、TLR-4激活組，分別以PBS、TLR-3激動劑（Poly[I:C]，SIGMA P9582-5MG1μg/ml）、TLR-4激動劑（LPS，SIGMA L2630-10MG1μg/ml）處理后。三組細(xì)胞均進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。培養(yǎng)第14天，以阿利新藍(lán)染色檢測蛋白多

3、糖的形成，以免疫熒光及Western blot法檢測II型膠原的表達(dá)，以實(shí)時熒光定量PCR檢測Sox-9的表達(dá)。
　　結(jié)果:以Ficoll密度梯度離心法成功分離得到成纖維樣貼壁生長的細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)檢測表面標(biāo)志物表達(dá)，結(jié)果為CD34（—）、CD44（+）、CD54（+）、CD90（+），符合BMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)特點(diǎn)，證實(shí)分離培養(yǎng)所得細(xì)胞為大鼠BMSCs。分組處理前，細(xì)胞并不表達(dá)蛋白多糖及II型膠原，BMSCs在化學(xué)組成上并不

4、表現(xiàn)出成軟骨細(xì)胞的特性。經(jīng)過2周成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，空白組、TLR-3激活組和TLR-4激活組均生成了蛋白多糖，阿利新藍(lán)染色均為陽性，計(jì)數(shù)并比較發(fā)現(xiàn)，三組間陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.628， P=0.547>0.05）。免疫熒光及Western-blot結(jié)果顯示，三組均表達(dá)II型膠原，但空白組表達(dá)明顯低于TLR-3激活組和TLR-4激活組（t3=3.993，P3=0.003<0.05；t4=7.650，P4=0.000<0.0

5、5），而后兩組間無明顯差異（t=0.934，P=0.372>0.05）。PCR結(jié)果顯示，TLR-3和TLR-4激活組Sox-9相對表達(dá)量分別是對照組Sox-9表達(dá)量的2.2倍和2.14倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t3=4.47，P3=0.00<0.05；t4=3.61， P4=0.02<0.05），而前兩組之間Sox-9的表達(dá)量無明顯差異（t=1.12，P=0.27>0.05）。
　　結(jié)論:經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，大鼠BMSCs能夠形