Toll樣受體4在成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中對干細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　探索Toll樣受體4(Toll Like Receptor，TLR)-4在“干細(xì)胞（上室）-成骨細(xì)胞（下室）”共培養(yǎng)體系中對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrowmensenchymal stem cells，BMSCs)向破骨細(xì)胞分化的影響及機(jī)制。
　　方法：
　　以Percoll密度梯度離心法分離大鼠BMSCs，常規(guī)培養(yǎng)、傳代，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。取第3代活力良好的細(xì)胞以流式細(xì)胞技術(shù)檢測經(jīng)典干細(xì)胞表

2、面標(biāo)志物CD34、CD44、CD54、CD90，鑒定干細(xì)胞。取孔徑為8μm的Transwell小室，將第3代活力良好的BMSCs制成細(xì)胞懸液（密度為1×107/ml）置于共培養(yǎng)小室的上室;將由大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化而來的大鼠成骨細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)、傳代并鑒定后，取活力較好的第3代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液（密度為1×107/ml）置于共培養(yǎng)小室的下室，構(gòu)建“干細(xì)胞-成骨細(xì)胞”共培養(yǎng)體系。將構(gòu)建完成的“干細(xì)胞-成骨細(xì)胞”共培養(yǎng)體系分為TLR-4激活組和

3、空白組，前者上室中加入TLR-4激動劑脂多糖(10ng/ml)，后者上室中加入等體積PBS緩沖液，兩組的上室中均加入破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)第6天，分別取TLR-4激活組和空白組上室細(xì)胞制成細(xì)胞爬片，進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acidphosphatase，TRAP)染色，染色陽性認(rèn)為是破骨細(xì)胞，比較兩組上室破骨細(xì)胞數(shù)目。在培養(yǎng)第6天，分別取2組下室細(xì)胞懸液，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參，蛋白質(zhì)印跡

4、法（Western blot法）檢測并比較核因子κB受體活化因子配體(Receptoractivator for nuclear factor-κB ligand，RAKL)的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　Percoll密度梯度離心法獲得細(xì)胞，鏡下觀察原代細(xì)胞由最初的散在的非貼壁細(xì)胞逐漸形成集落并貼壁，形態(tài)由小圓形淋巴細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維細(xì)胞樣。經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)鑒定，細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)為CD34陰性，CD44陽性，CD54陽性，CD

5、90陽性，符合BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)特征。細(xì)胞在“干細(xì)胞-成骨細(xì)胞”共培養(yǎng)體系中經(jīng)干預(yù)措施處理后，TRAP染色結(jié)果顯示，TLR-4激活組上室中破骨細(xì)胞數(shù)目（55.83±2.44個）多于空白組上室細(xì)胞中破骨細(xì)胞數(shù)目（37.50±2.20個），結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.556，P＜0.05）。Western blot法檢測結(jié)果顯示，TLR-4激活組RANKL的蛋白表達(dá)較空白組RANKL的蛋白表達(dá)更為明顯，定量分析顯示差異具有統(tǒng)計