Toll樣受體4在成骨細胞共培養(yǎng)體系中對干細胞向破骨細胞分化的影響及機制.pdf

1、目的：
　　探索Toll樣受體4(Toll Like Receptor，TLR)-4在“干細胞（上室）-成骨細胞（下室）”共培養(yǎng)體系中對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrowmensenchymal stem cells，BMSCs)向破骨細胞分化的影響及機制。
　　方法：
　　以Percoll密度梯度離心法分離大鼠BMSCs，常規(guī)培養(yǎng)、傳代，鏡下觀察細胞形態(tài)。取第3代活力良好的細胞以流式細胞技術(shù)檢測經(jīng)典干細胞表

2、面標志物CD34、CD44、CD54、CD90，鑒定干細胞。取孔徑為8μm的Transwell小室，將第3代活力良好的BMSCs制成細胞懸液（密度為1×107/ml）置于共培養(yǎng)小室的上室;將由大鼠BMSCs誘導分化而來的大鼠成骨細胞株進行培養(yǎng)、傳代并鑒定后，取活力較好的第3代細胞制成細胞懸液（密度為1×107/ml）置于共培養(yǎng)小室的下室，構(gòu)建“干細胞-成骨細胞”共培養(yǎng)體系。將構(gòu)建完成的“干細胞-成骨細胞”共培養(yǎng)體系分為TLR-4激活組和

3、空白組，前者上室中加入TLR-4激動劑脂多糖(10ng/ml)，后者上室中加入等體積PBS緩沖液，兩組的上室中均加入破骨細胞誘導培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)第6天，分別取TLR-4激活組和空白組上室細胞制成細胞爬片，進行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acidphosphatase，TRAP)染色，染色陽性認為是破骨細胞，比較兩組上室破骨細胞數(shù)目。在培養(yǎng)第6天，分別取2組下室細胞懸液，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參，蛋白質(zhì)印跡

4、法（Western blot法）檢測并比較核因子κB受體活化因子配體(Receptoractivator for nuclear factor-κB ligand，RAKL)的蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　Percoll密度梯度離心法獲得細胞，鏡下觀察原代細胞由最初的散在的非貼壁細胞逐漸形成集落并貼壁，形態(tài)由小圓形淋巴細胞樣轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維細胞樣。經(jīng)流式細胞技術(shù)鑒定，細胞表面標志物表達為CD34陰性，CD44陽性，CD54陽性，CD

5、90陽性，符合BMSCs細胞表面標志物表達特征。細胞在“干細胞-成骨細胞”共培養(yǎng)體系中經(jīng)干預措施處理后，TRAP染色結(jié)果顯示，TLR-4激活組上室中破骨細胞數(shù)目（55.83±2.44個）多于空白組上室細胞中破骨細胞數(shù)目（37.50±2.20個），結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（t=13.556，P＜0.05）。Western blot法檢測結(jié)果顯示，TLR-4激活組RANKL的蛋白表達較空白組RANKL的蛋白表達更為明顯，定量分析顯示差異具有統(tǒng)計