腺病毒介導的ING4-p53雙基因治療乳腺癌的協(xié)同抑瘤效應及其機制研究.pdf

1、目的：探討腺病毒介導的ING4/p53雙抑癌基因治療乳腺癌的療效及其機制。
　　方法：
　　1.分別以pAdTrack-CMV/ING4質粒和p53 ORF克隆質粒為模板，PCR擴增ING4（BglII、SalI）和 p53（XhoI、XbaI）目的片段，分別亞克隆至 pAdTrack-CMV/polyA+hEF1a-eIF4g轉移載體構建pAdTrack-CMV/ING4/polyA+
　　hEF1a-eIF4g/p

2、53雙基因共表達重組轉移載體。
　　2.將構建正確的 pAdTrack-CMV/ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53重組轉移載體經PmeI酶切后與pAdEasy-1腺病毒骨架質粒在BJ5183大腸桿菌中進行同源重組，得到的同源重組質粒 pAdEasy-1-pAdTrack-CMV/ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53（簡稱為pAd-ING4/p53）經PacI酶切后再用脂質體轉染HEK-293細胞，

3、經多輪感染、擴增、純化后獲得AdVING4/p53雙基因共表達重組腺病毒載體。
　　3.利用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）和建立裸鼠人乳腺癌皮下移植瘤模型檢測AdVING4/p53對MDA-MB-231乳腺癌細胞體外、BALB/c裸鼠體內生長的影響。
　　4. Annexin V-PE/7-AAD雙染法流式細胞儀（FCM）和 TUNEL法分別檢測AdVING4/p53在體外、BALB/c裸鼠體內誘導MDA-MB-231乳腺

4、癌細胞凋亡的作用。
　　5. Western blot檢測AdVING4/p53對MDA-MB-231乳腺癌細胞p53、乙酰化p53、P21、Bax、PUMA、Noxa、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3和PARP表達的影響；免疫組化檢測AdVING4/p53對BALB/c裸鼠MDA-MB-231乳腺癌皮下移植瘤p53、乙?；痯53、P21、Bax、PUMA、Noxa、Bcl-2、剪切型Caspase-3和CD31

5、表達的影響。
　　結果:
　　1.成功構建了 pAdTrack-CMV/ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53重組轉移質粒和pAd-ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53同源重組腺病毒質粒，及獲得了ING4和p53的雙基因共表達重組腺病毒AdVING4/p53。
　　2. AdVING4/p53有效地介導了 ING4和 p53在 HEK-293人胚腎細胞、MDA-MB-231人乳腺癌細胞中的

6、轉基因和共表達。
　　3.腺病毒介導的ING4和p53雙基因共表達（AdVING4/p53）在體外、BALB/c裸鼠體內均能明顯抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞生長和誘導凋亡，并且具有協(xié)同效應。
　　4. AdVING4/p53具有增強上調 MDA-MB-231乳腺癌乙酰化 p53、P21、Bax、PUMA、Noxa、剪切型Caspase-9、剪切型Caspase-3、剪切型PARP和下調Bcl-2的效應。
　　5.