活體成像技術(shù)評價脂質(zhì)體介導(dǎo)的乳腺癌基因治療.pdf

1、研究背景：隨著近年來乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)增長，病死率居高不下，尋求一種新的有效的腫瘤治療手段，已成為乳腺癌治療研究領(lǐng)域亟需解決的問題。自殺基因胸腺嘧啶核苷激酶(TK)在抗腫瘤研究中有較大的應(yīng)用價值。陽離子脂質(zhì)體作為一種非病毒基因載體，能夠有效的促進體內(nèi)和體外基因的轉(zhuǎn)染，具有基因負載量高，安全性好等優(yōu)勢，已成功的應(yīng)用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和腫瘤治療的研究中。然而，對于陽離子脂質(zhì)體在活體生物體內(nèi)介導(dǎo)外源性基因轉(zhuǎn)移的行為，尚缺乏有效的追蹤監(jiān)測平臺以及準

2、確評價轉(zhuǎn)染效率的技術(shù)手段。而基于分子影像技術(shù)的活體成像系統(tǒng)，具有無創(chuàng)傷性、可視性和量化的特點，可以填補這一研究方法的空白。以熒光素酶報告基因為基礎(chǔ)的小動物活體成像，可以用來標記腫瘤細胞，隨后追蹤標記的腫瘤細胞在動物體內(nèi)的命運；也可以用來標記研究的目的基因，觀察活體動物體內(nèi)基因的表達。當對兩種或以上的熒光素酶報告基因同時或先后進行活體成像時，則可在同一時間段內(nèi)觀察到同一個體體內(nèi)發(fā)生的兩種以上的生物學(xué)過程。這種基于雙報告基因或多報告基因的熒

3、光素酶活體成像技術(shù)，為我們在本研究中評價陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移效率及探索其在腫瘤治療中的應(yīng)用，評價自殺基因?qū)δ[瘤的治療作用等提供了潛在的平臺。
　　 研究目的：我們采用活體成像技術(shù)，目的在于跟蹤監(jiān)測移植的乳腺腫瘤細胞在小鼠體內(nèi)的命運，觀察移植瘤的生長、衰退和對治療的反應(yīng)，并評價陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的TK自殺基因在腫瘤組織內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染效率，以及脂質(zhì)體介導(dǎo)的TK自殺基因治療對乳腺癌的抗腫瘤效果。我們同時探索螢火蟲熒光素酶、海腎熒

4、光素酶雙報告基因的活體成像技術(shù)在研究腫瘤的治療效果和評價脂質(zhì)體基因傳遞效率等多方面的應(yīng)用價值。
　　 研究方法：首先為了驗證直接注射到組織內(nèi)的質(zhì)粒DNA的表達狀況，和探索陽離子脂質(zhì)體促進DNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染的作用，我們在BALB/c小鼠后肢進行肌肉內(nèi)注射：右側(cè)后肢肌肉內(nèi)注射陽離子脂質(zhì)體和Rluc-RFP-TIK質(zhì)粒DNA(表達海腎熒光素酶-紅色熒光蛋白-截短的胸腺嘧啶核苷激酶融合蛋白)的混合物，左側(cè)注射用PBS稀釋的同質(zhì)量的Rluc-

5、RFP-TTK質(zhì)粒DNA。每隔一周進行Rluc信號的活體成像，觀察基因的表達。然后，我們通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，使用一個表達融合蛋白(增強的綠色熒光蛋白-螢火蟲熒光素酶)的報告基因質(zhì)粒eGFP-Fluc(DF)標記BALB/c小鼠來源的乳腺癌細胞系4T1，經(jīng)過流式細胞儀篩選GFP陽性細胞群，得到穩(wěn)定表達eGFP-Fluc的4T1細胞(4T1-DF)。將4T1-DF細胞以5×105/接種部位的細胞數(shù)注射接種至雌性BALB/c小鼠肩部兩側(cè)皮下，

6、使其成瘤。從接種的第2天起，每隔4天，重復(fù)進行Fluc的小鼠活體成像，觀察腫瘤的生長狀況，直到體內(nèi)實驗結(jié)束。在腫瘤細胞接種一周后，連續(xù)重復(fù)3次進行腫瘤內(nèi)基因注射治療：每只荷瘤小鼠的一側(cè)腫瘤內(nèi)給予陽離子脂質(zhì)體和Rluc-RFP-TTK質(zhì)粒DNA的混合物，另一側(cè)給予以PBS稀釋的相等質(zhì)量的Rluc-RFP-TTK質(zhì)粒DNA。在3天后開始每天腹腔給予更昔洛韋藥物。自腫瘤內(nèi)基因注射第2天開始，每隔4天進行Rluc的小鼠活體成像觀察Rluc-RF

7、P-TTK質(zhì)粒的表達。在持續(xù)給予更昔洛韋藥物約半個月后，分離腫瘤組織，進行冰凍切片，用免疫熒光檢測腫瘤組織內(nèi)的RFP蛋白表達，TUNEL檢測腫瘤組織內(nèi)的凋亡，和用CD31抗體對腫瘤內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞染色觀察腫瘤內(nèi)血管新生情況。結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)，單純質(zhì)粒注射可以在肌組織細胞內(nèi)表達相應(yīng)蛋白，表達持續(xù)的時間至少在一個半月，陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)?；旌献⑸淇梢燥@著提高這種質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率從而提高表達水平。4T1-DF乳腺癌模型的自殺基因治療實驗中，我

8、們發(fā)現(xiàn)在有脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移組腫瘤內(nèi)Rluc信號強度要明顯高于無脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移組(對照組)；脂質(zhì)體介導(dǎo)的TTK自殺基因治療使移植瘤縮小的程度和阻抑腫瘤生長的程度要遠遠高于對照組；對腫瘤組織切片的RFP免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)在脂質(zhì)體介導(dǎo)的TTK自殺基因治療組的腫瘤組織內(nèi)，RFP表達明顯較多；TUNEL凋亡染色提示腫瘤組織內(nèi)有凋亡的發(fā)生，脂質(zhì)體介導(dǎo)的TTK自殺基因治療組的腫瘤內(nèi)凋亡細胞的比例明顯高于對照組；對腫瘤內(nèi)CD31的熒光染色說明

9、，腫瘤內(nèi)血管新生的數(shù)量在脂質(zhì)體介導(dǎo)的TTK自殺基因治療組內(nèi)較對照組有所下降。
　　 結(jié)論：基于雙報告基因的活體成像是研究脂質(zhì)體介導(dǎo)的腫瘤基因治療、評估陽離子脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)移效率的有效工具。eGFP-Fluc雙融合報告基因用于標記腫瘤細胞和追蹤腫瘤細胞在體內(nèi)的命運，Rluc-RFP-TTK三重融合基因分別以Rluc信號和RFP來報告TTK自殺基因在腫瘤內(nèi)的表達，都是可用于腫瘤治療研究的重要手段。陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的TTK自殺基因治療在