腺病毒介導(dǎo)的ING4和IL-24共表達(dá)對(duì)肝癌的抑瘤增效和化療增敏效應(yīng)及分子機(jī)制.pdf

1、構(gòu)建ING4和IL-24雙基因共表達(dá)腺病毒載體(Ad-ING4-IL-24)，研究其對(duì)肝癌的抑瘤增效和化療增敏效應(yīng)及分子機(jī)制。 方法：分別以pGEZ-Term、pAdTrack-CMV-IL-24和pAdTrack-CMV-ING4質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增IRES(SalI、NotI)、IL-24(XhoI、XbaI)和ING4(BglII、SalI)目的片段，依次亞克隆至pAdTrack-CMV轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建pAdTrack-CM

2、V-ING4-IRES-IL-24雙基因共表達(dá)重組轉(zhuǎn)移載體。將構(gòu)建正確的pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24重組轉(zhuǎn)移載體經(jīng)PmeI酶切后與pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒在BJ5183大腸桿菌中同源重組，得到的同源重組質(zhì)粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24(簡(jiǎn)稱(chēng)為pAd-ING4-IRES-IL-24)經(jīng)PacI酶切后再用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞，經(jīng)多輪感染和擴(kuò)增后獲得

3、Ad-ING4-IRES-IL-24雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體。polyA+promoter介導(dǎo)的ING4和IL-24雙基因共表達(dá)腺病毒載體(Ad-ING4-polyA+promoter-IL-24)的構(gòu)建方法基本同上，唯一不同的是polyA+promoter片段的獲得是：以pORF-mbcl-2a質(zhì)粒為模板，PCR分別擴(kuò)增polyA和promoter片段；再以此為模板，SOE-PCR擴(kuò)增polyA+promoter融合片段。將Ad-I

4、NG4-IRES-IL-24(簡(jiǎn)稱(chēng)為Ad-ING4-IL-24)體外感染SMMC-7721、HepG2肝癌細(xì)胞及聯(lián)合順鉑(CDDP)化療藥物作用，MTT法和FCM檢測(cè)其體外抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的協(xié)同增效和化療增敏效應(yīng)，并建立SMMC-7721裸鼠人肝癌移植瘤模型，觀察Ad-ING4-IL-24體內(nèi)對(duì)裸鼠人肝癌移植瘤的抑瘤增效作用。侵襲小室檢測(cè)Ad-ING4-IL-24體外對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。Western

5、blot和免疫組化檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白及腫瘤血管形成相關(guān)因子P53、P21、P27、Cox-2、Fas、Bcl-2、Bax、Caspase-3、VEGF、CD34的表達(dá)。ELISA和半定量RT-PCR法檢測(cè)Ad-ING4-IL-24對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞促血管形成因子VEGF、IL-8和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響。 結(jié)果：成功構(gòu)建了IRES和雙啟動(dòng)子(polyA+promoter)介導(dǎo)的兩種IN

6、G4和IL-24雙基因共表達(dá)腺病毒載體(Ad-ING4-IRES-IL-24和Ad-ING4-polyA+promoter-IL-24)。腺病毒介導(dǎo)的ING4和IL-24雙基因共表達(dá)(Ad-ING4-IL-24)體外能明顯抑制SMMC-7721、HepG2肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡及抑制SMMC-7721細(xì)胞的體外侵襲能力，體內(nèi)同樣能明顯抑制SMMC-7721裸鼠人肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，且均具協(xié)同抑瘤增效作用；而且Ad-ING4-IL-24能

7、提高CDDP化療藥物體外抑制SMMC-7721、HepG2肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用，具有顯著的化療增敏效應(yīng)。分子機(jī)制檢測(cè)結(jié)果表明：Ad-ING4-IL-24能明顯上調(diào)SMMC-7721肝癌細(xì)胞P53、P21、P27、Fas、Bax、Caspase-3和下調(diào)Cox-2、Bcl-2等細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；能明顯下調(diào)腫瘤血管形成因子VEGF、IL-8、CD34的表達(dá)；還能明顯下調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2、MMP-9的表達(dá)，且其

8、效應(yīng)均較Ad-ING4、Ad-IL-24更為顯著。 結(jié)論： 1、國(guó)內(nèi)外首次成功構(gòu)建了兩種ING4和IL-24雙基因共表達(dá)腺病毒載體Ad-ING4-IRES-IL-24和Ad-ING4-polyA+promoter-IL-24。 2、Ad-ING4-IL-24雙基因表達(dá)及聯(lián)合CDDP化療藥物體外抑制SMMC-7721、HepG2肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡呈現(xiàn)明顯的協(xié)同抑瘤增效作用和化療增敏效應(yīng)。 3、Ad-IN

9、G4-IL-24雙基因表達(dá)體內(nèi)抑制SMMC-7721裸鼠人肝癌移植瘤同樣具有協(xié)同抑瘤增效作用。 4、Ad-ING4-IL-24雙基因表達(dá)更具顯著上調(diào)P53、P21、P27、Fas、Bax、Caspase-3和下調(diào)Cox-2、Bcl-2等細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的效應(yīng)，這可能是其雙基因表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)抑制具有協(xié)同抑瘤增效作用的重要機(jī)制之一。 5、Ad-ING4-IL-24雙基因表達(dá)更具顯著下調(diào)腫瘤血管形成因子VE