雙調(diào)控溶瘤腺病毒攜帶超抗原SEA基因治療前列腺癌基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建表達超抗原SEA基因的由前列腺特異性抗原（PSA）啟動子及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）啟動子雙調(diào)控的特異性增殖溶瘤腺病毒SG504-SEA。體外實驗觀察SEA基因的表達及其刺激淋巴細胞對腫瘤的殺傷功能，及SEA 促細胞因子分泌作用。
　　 方法：從前列腺癌組織基因組DNA中獲得522bp大小的PSA 啟動子序列，將PSA啟動子克隆到由hTERT 啟動子調(diào)控的特異性增殖溶瘤腺病毒載體SG502中，得到靶向前列腺癌細胞的雙

2、調(diào)控溶瘤腺病毒載體SG504。將已構(gòu)建好的含有771bp大小SEA基因片段的病毒骨架質(zhì)粒PPE3-ccdb-SEA 與SG504 用Lipofectamine2000 共轉(zhuǎn)染至293細胞。共轉(zhuǎn)染后9～14d 出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為SG504-SEA,即攜帶SEA基因的雙調(diào)控靶向前列腺癌的特異性溶瘤腺病毒。通過RT-PCR 檢測SEA 在前列腺癌DU145 細胞內(nèi)不同時間段mRNA表達，分別于12、2

3、4、48h 提取細胞總RNA 行RT-PCR 檢測SEA 在核酸水平的表達量；將重組病毒以5MOI的滴度感染腫瘤細胞DU145，分別于12、24、48h 取出，免疫熒光定位SEA表達于前列腺癌細胞；western blot測定SEA蛋白表達；顯微鏡下動態(tài)觀測淋巴細胞與前列腺癌細胞共培養(yǎng)，ELISA 檢測TNF和IL-2分泌。
　　 結(jié)果：經(jīng)PCR及酶切鑒定，SEA基因成功克隆到病毒載體中，可以表達SEA基因，且病毒滴度為2.0×

4、1010pfu/ml。RT-PCR 檢測SG504-SEA 在腫瘤細胞內(nèi)不同時段mRNA的表達，瓊脂糖電泳252bp 處可見清晰條帶，轉(zhuǎn)染前列腺癌DU145 細胞在12、24、48小時持續(xù)表達SEA mRNA；免疫熒光定位DU145 細胞表面可以看到明顯的熒光表達,可以確定SEA基因表達于前列腺腫瘤的細胞膜上,并且不同時段細胞表達熒光的亮度存在差別，隨著時間增加熒光表達逐漸增強；SDS-PAGE 電泳后用考馬斯亮藍染色顯示在27kDa

5、附近可看到明顯條帶,而未轉(zhuǎn)染細胞不存在。Western-blot 結(jié)果證實SEA蛋白的表達成功；淋巴細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)12、24、48h 實驗組腫瘤細胞明顯少于對照組，表明DU145 細胞與淋巴細胞共同培養(yǎng)的過程中,轉(zhuǎn)染SEA基因的腫瘤細胞相對未轉(zhuǎn)染的細胞更易被淋巴細胞捕獲殺傷，對淋巴細胞有一定的趨化作用；ELISA 檢測TNF和IL-2分泌量實驗組均高于對照組。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了表達超抗原SEA基因的雙調(diào)控選擇增殖型溶