謝氏丙酸桿菌維生素B-,12-代謝途徑基因組改組.pdf

1、維生素B12作為動(dòng)物和人體的一種必需維生素，廣泛地用于治療惡性貧血，配制維生素復(fù)合制劑，動(dòng)物飼料和食品的添加劑等方面。其應(yīng)用前景廣闊，需求量巨大，雖然近年來(lái)全球產(chǎn)量有較大的提高，但仍供不應(yīng)求。國(guó)內(nèi)只有少數(shù)的廠家生產(chǎn)且多為引進(jìn)國(guó)外生產(chǎn)技術(shù)，但與國(guó)外先進(jìn)水相比平仍有較大差距。因此展開(kāi)維生素B12高產(chǎn)菌株的選育和生物技術(shù)的研究，提高國(guó)內(nèi)生產(chǎn)技術(shù)就顯得非常重要。 通過(guò)分離純化，獲得一株維生素B12產(chǎn)量為1.85mg/L的謝氏丙酸桿菌(P

2、ropionibacterium shermanii)作為出發(fā)菌株，命名為P.shermanii-17。采用亞硝基胍-紫外線與甲磺酸乙酯-紫外線兩種不同復(fù)誘變方法對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，在丙酸為pH6.0，含乙硫氨酸和四氯化碳的抗性培養(yǎng)基上篩選獲得了2株維生素B12產(chǎn)量為2.31 mg/L和2.42 mg/L的正突變株，分別比母株提高25％和31％，命名為P.shermanii—NU—31和P.shermanii—EU—49。 利用

3、滅活雙親原生質(zhì)體融合方法，對(duì)謝氏丙酸桿菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，確定滅活雙親原生質(zhì)體融合的條件為：種子液培養(yǎng)48 h，懸浮于0.5 mol/L蔗糖·丁二酸鈉(1∶1)高滲緩沖液，10 mg/ml溶菌酶酶解2h；在紫外線和60℃水浴中分別滅活45 min和2h，將兩滅活親本稀釋至106個(gè)/ml后等量混合，PEG6000融合液融合6 min，抗性再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)4周。 應(yīng)用雙親滅活原生質(zhì)體融合法對(duì)謝氏丙酸桿菌進(jìn)行兩輪

4、基因組改組，在丙酸為pH5.5的抗性培養(yǎng)基上篩選獲得一株維生素B12產(chǎn)量為2.85 mg/L，比母株提高54％的菌株，命名為P.shermanii—F2-3。將改組菌株和母株進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程比較，菌體濃度、丙酸耐受性和維生素B12產(chǎn)量均不同程度提高，表明基因組改組技術(shù)能有效提高多基因調(diào)控表型的進(jìn)化。 為了揭示基因組改組菌的代謝調(diào)控機(jī)制，研究了基因組改組菌與出發(fā)菌之間的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜的差異。提取發(fā)酵第四天改組株P(guān).shermanii—

5、F2-3和母株P(guān).shermanil-17的胞內(nèi)蛋白進(jìn)行雙向電泳，通過(guò)Image Master軟件分析兩菌株凝膠，搜索Swiss2D—PAGE數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)的等電點(diǎn)(pI)、分子量(Mw)，找出基因組改組菌株38個(gè)表達(dá)量改變蛋白，其中上調(diào)蛋白22個(gè)，16個(gè)下調(diào)蛋白，28個(gè)蛋白已在數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。并且確定改組株6個(gè)維生素B12主要相關(guān)代謝途徑上調(diào)蛋白：谷氨酰tRNA合成酶(Glutaminyl—tRNA synthetase，glnS)、δ—