轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)對(duì)花生過(guò)敏原Arah2結(jié)構(gòu)與性質(zhì)影響研究.pdf

1、食物過(guò)敏(Food Allergy，F(xiàn)A)是世界各地普遍存在的一個(gè)食品安全問(wèn)題，其發(fā)病率的不斷增長(zhǎng)，引起了人們的廣泛關(guān)注。花生是八大食物過(guò)敏原之一，其引起的過(guò)敏反應(yīng)具有終身性，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏性休克，危及生命。Ara h2被認(rèn)為是花生中致敏性最強(qiáng)的過(guò)敏原，通過(guò)加工降低它的致敏性，對(duì)保障食品安全具有重要意義。
　　本研究?jī)?yōu)化了微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTG）交聯(lián)花生過(guò)敏原Ara h2的條件，表征了Ara h2蛋白在經(jīng)還原、交聯(lián)處理后結(jié)構(gòu)

2、的變化，分析了還原蛋白和交聯(lián)蛋白的消化穩(wěn)定性，并評(píng)估了它們的致敏性。研究的主要方法、結(jié)果及結(jié)論如下：
　　1首先對(duì)Ara h2進(jìn)行還原處理，探討還原處理對(duì)花生過(guò)敏原Ara h2交聯(lián)性質(zhì)的影響，然后分析其他各反應(yīng)條件對(duì)交聯(lián)的影響，建立了花生過(guò)敏原Ara h2交聯(lián)反應(yīng)體系。天然Ara h2在MTG催化下不易發(fā)生交聯(lián)，經(jīng)過(guò)二硫蘇糖醇（DTT）還原處理之后，Ara h2中的游離氨基暴露出來(lái)，在MTG的催化下形成了聚合物。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，除還原

3、劑濃度外其它因素對(duì)蛋白交聯(lián)的影響較小，優(yōu)化得到的最佳交聯(lián)條件為：當(dāng)?shù)鞍诐舛葹? mg/mL時(shí)，還原劑 DTT濃度為0.1 mg/mL，酶活蛋白比為300 U/g，溶液pH值為7.5，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為3h。
　　2利用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）分析交聯(lián)Ara h2蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，然后對(duì)得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與理論交聯(lián)片段相匹配，尋找交聯(lián)位點(diǎn)。采用圓二色譜、紫外光譜以及熒光光譜分析還原蛋白和交聯(lián)蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化。實(shí)驗(yàn)中從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中匹

4、配出5個(gè)交聯(lián)肽段，發(fā)現(xiàn)K130是較為活躍的交聯(lián)位點(diǎn)，這些交聯(lián)位點(diǎn)涉及到5個(gè)線性過(guò)敏原表位。蛋白還原后α-螺旋含量降低，β-折疊含量升高，紫外吸光強(qiáng)度升高，蛋白的疏水性明顯增強(qiáng)，說(shuō)明蛋白還原后其結(jié)構(gòu)展開。而蛋白交聯(lián)后α-螺旋結(jié)構(gòu)含量升高，β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低，紫外吸光強(qiáng)度低于天然蛋白和還原蛋白，說(shuō)明蛋白經(jīng)交聯(lián)后結(jié)構(gòu)變得更加緊密。
　　3采用模擬胃、腸消化研究還原蛋白與交聯(lián)蛋白的消化性變化。研究顯示，天然Ara h2具有抗胃消化能力，

5、經(jīng)過(guò)80min胃消化，仍有91％ Ara h2未被降解。還原蛋白在胃蛋白酶的作用下迅速生成14 kDa與5 kDa片段，并且隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，這兩個(gè)片段逐漸被酶解成分子量小于3.5 kDa的小分子肽。交聯(lián)蛋白的胃消化消化速率要高于天然蛋白，但要低于還原蛋白，消化片段的分子量主要分布5~17 kDa之間。腸消化結(jié)果顯示，天然蛋白能緩慢被消化，經(jīng)過(guò)40min消化后分子量為13 kDa的抗消化片段仍然存在，而還原蛋白胃消化產(chǎn)物在胰酵素的作用

6、下迅速分解成分子量小于3.5 kDa的片段，交聯(lián)蛋白胃消化產(chǎn)物也能被胰酵素迅速消化，經(jīng)過(guò)5 min全部分解成分子量小于3.5 kDa的肽段。本研究證實(shí)了天然Ara h2具有抗胃消化的性質(zhì)，還原處理能打開蛋白的結(jié)構(gòu)，暴露出更多的胃蛋白酶作用位點(diǎn)，改善其消化性。蛋白交聯(lián)前進(jìn)行了還原處理，故交聯(lián)蛋白具有部分還原蛋白的性質(zhì)，其消化速率明顯快于天然蛋白，而蛋白交聯(lián)過(guò)程中，結(jié)構(gòu)更為緊密，并且生成了抗消化的異肽鍵，這可能降低了蛋白的消化速率。

7、　　4選用花生患者血清作為反應(yīng)一抗，通過(guò)間接ELISA法檢測(cè)加工蛋白及其消化產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力變化。采用小鼠模型實(shí)驗(yàn)評(píng)估還原和交聯(lián)蛋白的致敏性變化。結(jié)果顯示，還原處理能降低蛋白Ara h2的部分IgE結(jié)合能力，而蛋白交聯(lián)后其致敏性顯著降低。加工蛋白經(jīng)胃蛋白酶消化后，其產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力均顯著低于天然蛋白的消化產(chǎn)物，而交聯(lián)蛋白的IgE結(jié)合能力最低。各加工蛋白胃消化產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)腸消化后，消化產(chǎn)物間的IgE結(jié)合能力不再有顯著差異。小鼠致敏實(shí)

8、驗(yàn)結(jié)果中，除細(xì)胞因子INF-γ外，還原蛋白組的特異性抗體水平、其他細(xì)胞因子水平均與天然蛋白組相當(dāng)。而交聯(lián)蛋白組中，小鼠特異性IgG1水平與IL-5含量水平與天然蛋白組相當(dāng)，而其他特異性抗體與Th1/Th2細(xì)胞因子水平較天然蛋白組有顯著降低。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，還原處理雖能降低Ara h2的部分體外IgE結(jié)合能力，但是其激發(fā)小鼠過(guò)敏反應(yīng)的能力未見(jiàn)降低，交聯(lián)處理則不僅能降低Ara h2的IgE結(jié)合能力，同時(shí)也降低其對(duì)小鼠過(guò)敏反應(yīng)的激發(fā)能力。因