匹羅卡品致癇小鼠海馬神經(jīng)元線粒體移動變化研究.pdf

1、目前全世界約有5000萬人患有癲癇，它是臨床上最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。由于長期反復發(fā)作，并且嚴重降低患者的生活質(zhì)量，因此探索癲癇的發(fā)病機制和積極尋找新的治療靶點具有重要意義。線粒體的功能在癲癇的影響下會發(fā)生紊亂，線粒體損傷促使呼吸鏈中活性氧增多，線粒體的DNA發(fā)生突變，巰基發(fā)生氧化，蛋白質(zhì)交聯(lián)。DNA的甲基化功能下降，最后引起一系列的病理改變，如組蛋白乙?；霈F(xiàn)異常以及生物膜脂質(zhì)被過度氧化，最終導致細胞內(nèi)堆積大量變性蛋白和受損細胞器。

2、膜電位在線粒體受到損傷時下降明顯，伴隨著線粒體通透性轉(zhuǎn)運增加，細胞色素C(Cyt c)和凋亡誘導因子(AIF)被釋放到細胞質(zhì)中誘導細胞凋亡，細胞凋亡促使神經(jīng)元對于癲癇損傷更加敏感，這形成惡性循環(huán)。所以，對受損的線粒體進行及時的清除非常關(guān)鍵。
　　線粒體移動在維持線粒體功能穩(wěn)定和清除受損線粒體方面發(fā)揮了非常重要的作用。線粒體移動可將受損線粒體逆行轉(zhuǎn)運至胞體被降解和回收，同時將正常線粒體順向運動至神經(jīng)元的作用部位而發(fā)揮功能。線粒體功能

3、正常情況下，線粒體通過移動來使得其分布正常，而且不僅如此，其還能夠?qū)⒕€粒體移動到合適的位置來應(yīng)對其損傷。
　　目前為止，針對線粒體移動的具體機制還不是完全清楚。Miro屬于小GTPase家族成員，與線粒體的移動密切相關(guān)。研究表明，Miro與Milton可在神經(jīng)細胞中形成復合物并與肌球蛋白重鏈(KHC)相連接，以此來控制微管內(nèi)線粒體的移動。線粒體的轉(zhuǎn)運在miro1突變時會受到抑制，使線粒體聚集形成為絲狀線粒體。此外，還有研究顯示，在

4、H9c2細胞及原代腦皮層神經(jīng)細胞中，Miro表達量的多少影響線粒體移動的活力。目前在癲癇發(fā)作后神經(jīng)元線粒體損傷中線粒體移動異常發(fā)揮何種作用還不清楚，然而，其能否通過控制線粒體的移動來影響神經(jīng)對其的保護作用，這點還有待研究。
　　目的:
　　本課題通過觀察匹羅卡品致癇小鼠海馬線粒體移動相關(guān)蛋白Miro1表達水平變化，探討線粒體移動在癲癇神經(jīng)元損傷中的作用，同時構(gòu)建腺病毒真核表達質(zhì)粒提高Miro1表達，觀察致癇小鼠行為學、神經(jīng)細

5、胞凋亡，海馬神經(jīng)元缺失的變化情況，以及檢測氧化應(yīng)激相關(guān)生理及分子指標MDA，Mn-SOD，GSH-Px和ND6變化情況，并通過檢測凋亡相關(guān)物質(zhì)Bax，Bcl-2，Bcl-xL，細胞色素c，caspase-3和caspase-9等表達水平變化，探討癲癇發(fā)作后神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護機制。
　　方法:
　　48只成年健康雄性的C57BL/6小鼠，體重在18-25g，隨機分成四組:正常組（正常小鼠）、致癇組（癲癇小鼠）、對照腺病毒組（

6、癲癇小鼠注射對照空載腺病毒）及Miro1過表達腺病毒組（癲癇小鼠注射Mrio1過表達重組腺病毒）。后兩組小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉（0.004ml/g），用腦立體定位儀取平顱位固定小鼠。剃去小鼠顱頂毛發(fā)，用75％的酒精消毒顱頂皮膚后，皮膚開口約1cm。再用碘伏消毒，顯出顱骨骨縫。定位AP=-0.3mm; ML=-1.0mm; DV=-2.0mm，注射2μl Miro1過表達重組腺病毒或者對照腺病毒載體，20min內(nèi)緩慢注射完畢，注射

7、后留針10min，將針尖移出，消毒后用骨蠟填塞骨孔，縫合皮膚。上述24h后后三組小鼠皮下注射1mg/kg的東莨菪堿，30min后腹腔注射匹羅卡品(340mg/kg)誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)。小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)發(fā)作90min時，腹腔注射地西泮(6mg/kg)終止癲癇發(fā)作。小鼠癲癇模型制作成功標準依據(jù)Racine癇性發(fā)作分級標準進行判定，造模成功后分別記錄小鼠的致癇成功率及潛伏期。小鼠在癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作24h時，被麻醉斷頭取腦，并迅速分離出雙側(cè)海

8、馬，臨死前進行腦電圖描記。Real-Time PCR法檢測Miro1 mRNA表達水平。檢測氧化應(yīng)激相關(guān)生理指標MDA，Mn-SOD及GSH-Px，并使用Western blot檢測小鼠海馬Miro1、ND6、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、細胞色素c、caspase-3和caspase-9等表達水平。剩余小鼠在癲癇持續(xù)狀態(tài)后72h時麻醉后灌注取腦，采用尼氏染色法檢測癲癇小鼠海馬神經(jīng)元損傷，并且采用TUNEL法檢測小鼠海馬神經(jīng)元凋亡情

9、況。
　　以均數(shù)±標準差((x)±s)來表示所有研究數(shù)據(jù)資料，統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS20.0軟件進行。致癇成功率采用卡方檢驗(Chi-Square Tests)比較，其余采用單因素方差分析方法(ANOVA)進行組間比較，兩組間比較采用LSD(Least-SignificantDifference)-t檢驗，顯著性水平為α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.致癇小鼠行為學觀察及腦電圖結(jié)果
　　正常組小鼠行為及腦電圖均

10、正常。按照Racine癇性發(fā)作分級，在腹腔注射匹羅卡品后，癲癇組、對照腺病毒組及Miro1過表達腺病毒組三組小鼠癇性發(fā)作級別可達到Ⅳ-Ⅴ級并出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，癲癇模型造模成功率以及癇性發(fā)作潛伏期在上述三組小鼠之間均無顯著性差異(p＞0.05);三組小鼠在腹腔注射匹羅卡品后腦電圖可以描記到多量的高幅的棘波、尖波及其棘（尖）慢綜合波。
　　2.病理學觀察
　　2.1 Nissl染色結(jié)果:
　　SE發(fā)作后72h時與正常組相比

11、，癲癇組、對照腺病毒組及Miro1過表達腺病毒組三組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元有明顯缺失，神經(jīng)元計數(shù)明顯減少，統(tǒng)計有顯著性差異(p＜0.05);SE后72h時與對照腺病毒組相比，Miro1過表達腺病毒組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元計數(shù)明顯增多，統(tǒng)計有顯著性差異(p＜0.05)。
　　2.2 TUNEL法結(jié)果:
　　SE發(fā)作后72h時與正常組相比，癲癇組、對照腺病毒組及Miro1過表達腺病毒組三組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯增多，有顯

12、著性差異(p＜0.05)。SE后72h時與對照腺病毒組相比，Miro1過表達腺病毒組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目減少，有顯著性差異(p＜0.05)。
　　3.線粒體移動相關(guān)蛋白Miro1表達檢測:
　　3.1 mRNA水平
　　相比于正常組，癲癇能夠顯著抑制小鼠海馬組織中Miro1 mRNA水平的表達(p＜0.05)，注射Miro1過表達重組腺病毒能夠有效上調(diào)小鼠海馬組織中Miro1的mRNA表達水平(p＜0.05)

13、。
　　3.2 蛋白水平
　　相比于正常組，癲癇能夠顯著抑制小鼠海馬組織中Miro1蛋白水平的表達(p＜0.05)，注射Miro1過表達重組腺病毒能夠有效上調(diào)小鼠海馬組織中Miro1的蛋白表達水平(p＜0.05)。
　　4.氧化應(yīng)激相關(guān)生理及分子指標檢測
　　相比于正常組，癲癇能夠顯著抑制小鼠海馬組織中Mn-SOD及GSH-Px的活性，上調(diào)MDA的水平，而注射Miro1過表達重組腺病毒能夠有效抑制癲癇誘導的MDA

14、積累，同時上調(diào)海馬組織中Mn-SOD及GSH-Px的活性(p＜0.05)。相比于正常組，癲癇能夠顯著抑制小鼠海馬組織中ND6的表達，而注射Miro1過表達重組腺病毒能夠有效提高海馬組織中ND6的水平(p＜0.05)。
　　5.凋亡相關(guān)蛋白表達檢測
　　數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，相比于正常組，癲癇能夠顯著抑制小鼠海馬組織中抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達水平，誘導促凋亡蛋白Bax以及caspase-3、caspase-9的表達

15、活化，胞漿中CytC含量升高，線粒體中CytC含量下降。Miro1過表達重組腺病毒注射能夠逆轉(zhuǎn)癲癇誘導的小鼠海馬組織中上述指標的變化。
　　結(jié)論:
　　1.癲癇模型小鼠海馬組織中Miro1 mRNA以及蛋白的表達水平均低于正常小鼠，這說明線粒體移動的變化是參與了癲癇病理損傷過程的。Miro1過表達重組腺病毒注射能夠一定程度上恢復海馬組織中Miro1的表達。
　　2.癲癇能夠誘導小鼠海馬組織線粒體損傷以及氧化應(yīng)激的發(fā)生，

16、Miro1過表達重組腺病毒注射能夠降低癲癇模型小鼠海馬組織中線粒體損傷以及氧化應(yīng)激程度。
　　3.癲癇能夠誘導小鼠海馬組織線粒體途徑細胞凋亡的發(fā)生，Miro1過表達重組腺病毒注射能夠抑制癲癇模型小鼠海馬組織中的細胞凋亡。
　　4.提高線粒體移動相關(guān)蛋白Miro1表達，可以通過降低致癇小鼠海馬組織中線粒體損傷以及氧化應(yīng)激程度并抑制海馬神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，這有可能成為癲癇發(fā)作后神經(jīng)損傷新的神經(jīng)保護治療靶點。提高線粒體移