姜黃素對匹羅卡品致癇鼠海馬神經(jīng)元保護作用的研究.pdf

1、目的：癲癇是人類常見的腦損傷性疾病，約有40％的人類癲癇起源于人腦顳葉故稱為顳葉癲癇。顳葉癲癇主要以海馬病變?yōu)橹鳎@可能與海馬結構獨特的神經(jīng)元環(huán)路及纖維聯(lián)系有關。這種顳葉癲癇的持續(xù)狀態(tài)會導致神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中谷氨酸濃度的病理性升高，而這種興奮性氨基酸的水平升高會介導和增強氧化應激反應。在神經(jīng)系統(tǒng)中海馬神經(jīng)元比其它區(qū)域的神經(jīng)元抵抗這種氧化應激反應損傷的能力要弱得多，因此海馬神經(jīng)元成為顳葉癲癇模型中最敏感的部位，故顳葉癲癇患者常伴有海馬

2、神經(jīng)元的損傷甚至丟失。研究表明癲癇72小時后引起海馬神經(jīng)元的丟失主要以細胞凋亡為主。姜黃素是一種從姜科植物Curcuma longa的根莖姜黃中提取的一種植物多酚，有抗氧化、抗炎、抗凝、抗腫瘤、抗突變等多方面的藥理作用。有文獻報道對海人酸誘導癲癇的實驗動物提前注射姜黃素，能減輕海人酸誘導癲癇所造成的海馬神經(jīng)元的損傷程度，從而減輕海馬神經(jīng)元的死亡。本實驗的目的是研究姜黃素對匹羅卡品癲癇模型小鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響。 材料與方法：

3、 一、實驗分組 CD-1小鼠，雌雄并用，共32只，體重18-22g，隨機分為4組，每組8只。 1、第一組為對照組(Ct1)；2、第二組為鋰-匹羅卡品誘導癲癇組(Pil)；3、第三組為提前18小時預注姜黃素的癲癇組(Cur+Pil)；4、第四組為單純注射姜黃素動物組(Cur)。 二、癲癇行為學觀察：CD-1小鼠腹腔注射鋰-匹羅卡品誘導癲癇，成模后觀察其行為學變化，參考Simialowski 6級(0-V)評定

4、法。 三、組織切片的制備：成模鼠于鋰-匹羅卡品誘導癲癇72小時后腹腔注射4％戊巴比妥鈉麻醉動物，然后用蠕動泵經(jīng)左心室灌流，取大腦，部分標本置于30％蔗糖液4℃冰箱保存過夜，制備10μm的冰凍切片，部分標本常規(guī)制成7μm的石蠟切片。10μm冰凍切片做甲酚紫染色，7μm的石蠟切片做TUNEL染色，凋亡因子Caspase-3和Caspase-9原位雜交的檢測。 四、染色 1、甲酚紫染色法：10μm的冰凍切片采用甲酚紫染

5、色法染色。切片空氣中晾干后常規(guī)染色10分鐘，沖洗后酒精梯度脫水，透明，封固，鏡下觀察。 2、TUNEL染色：TUNEL染色采用試劑盒，嚴格按照說明書操作，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，胃蛋白酶消化，滴加反應液20μl，然后滴加反應終止液，抗地高辛過氧化物酶抗體，最后DAB顯色，封片鏡下觀察。 3、凋亡因子的檢測：凋亡因子Caspase-3和Caspase-9的檢測采用試劑盒，按照說明常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，胃蛋白酶消化然后

6、PBS沖洗，經(jīng)過預雜交，雜交后洗,SABC37℃20分鐘，生物素過氧化物酶室溫30分鐘，沖洗后DAB顯色。 結果： 一、行為學觀察結果 提前18小時注射姜黃素后誘導癲癇的實驗動物組(Cur+Pil)和癲癇動物組(Pil)動物在誘導癲癇72小時后，均出現(xiàn)典型的癲癇大發(fā)作Ⅳ級-Ⅴ級不等并有部分動物出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)甚至自發(fā)性癲癇，而在對照組(Ctl)和單純注射姜黃素組(Cur)沒有發(fā)生癲癇。 二、姜黃素對癲癇動

7、物海馬神經(jīng)元的保護作用 1、甲酚紫染色檢測：姜黃素對癲癇動物海馬神經(jīng)元的保護作用在甲酚紫染色的切片上，匹羅卡品致癇組(Pil)動物在誘導癲癇72小時后海馬的CA1區(qū)和CA3區(qū)出現(xiàn)明顯的錐體神經(jīng)元死亡，而經(jīng)過提前18小時預注姜黃素的癲癇組(Cur+Pil)動物在誘導癲癇72小時后海馬錐體神經(jīng)元死亡數(shù)目減少，提示姜黃素對海馬神經(jīng)元有明顯的保護作用，有效的抑制了海馬神經(jīng)元的死亡。 2、TUNEL染色檢測：姜黃素對癲癇動物海馬神

8、經(jīng)元的保護作用TUNEL染色的結果與甲酚紫染色結果趨勢基本一致，有大量的TUNEL陽性細胞出現(xiàn)在匹羅卡品致癇組(Pil)動物的海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)，而經(jīng)過提前18小時預注姜黃素的癲癇組動物(Cur+Pil)的海馬神經(jīng)元中TUNEL陽性細胞明顯減少，表明姜黃素可以使癲癇鼠的海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)目減少，起到了對神經(jīng)元的保護作用。 3、凋亡因子檢測：姜黃素對癲癇動物海馬神經(jīng)元的保護作用用原位雜交技術分析凋亡因子Caspase-3和Cas

9、pase-9在各組動物海馬神經(jīng)元的表達，發(fā)現(xiàn)在匹羅卡品致癇組(Pil)動物的海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)中Caspase-3和Caspase-9陽性細胞明顯增多，而在經(jīng)過姜黃素注射的癲癇組(Cur+Pil)動物海馬神經(jīng)元中陽性細胞減少，從凋亡因子的角度說明姜黃素能有效的抑制凋亡因子和凋亡的產(chǎn)生，揭示了姜黃素抑制凋亡產(chǎn)生的途徑。 討論 動物實驗表明頻繁癲癇發(fā)作可導致腦神經(jīng)元的選擇性損傷和丟失，反復癇性發(fā)作72小時后可造成腦組織缺

10、血、缺氧，使活性氧自由基、NO等大量產(chǎn)生，其所誘導的細胞死亡從生物化學和形態(tài)學上都具有細胞凋亡的特征，因此推測細胞凋亡是癲癇患者大腦神經(jīng)元死亡的一種重要方式。癲癇最常見的受損神經(jīng)元是海馬CA1和CA3區(qū)的錐體細胞。已知的細胞凋亡有兩條途徑：一是TNF受體家族成員參與的通過caspase-8活化的外源性凋亡途徑；二是細胞色素C參與的通過caspase-9活化的內(nèi)源性凋亡。兩條途徑最后均通過激活下游的效應因子caspase-3，7誘導細胞發(fā)

11、生凋亡。從本研究的結果可以看出在匹羅卡品誘導癲癇組動物的海馬中，甲酚紫染色的CA1區(qū)和CA3區(qū)的存活細胞較少，證明了癲癇可以導致細胞的丟失或死亡，而為了進一步證明這種癲癇72小時后的細胞丟失或死亡屬于凋亡，我們做了TUNEL檢測,證實了癲癇72小時后的細胞丟失或死亡屬于細胞凋亡。在進一步的試驗中，為了探討這種凋亡產(chǎn)生的途徑，我們檢測了凋亡因子caspase-3，9，結果表明癲癇組動物的海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)凋亡因子陽性反應細胞較明顯數(shù)量

12、較多，進一步提示了這種癲癇引起的變化可能是一種內(nèi)源性途徑的細胞凋亡。 姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗凝、抗腫瘤、抗突變等多方面的藥理作用，我們對癲癇組動物預注姜黃素，并比較分析了TUNEL的檢測及內(nèi)源性凋亡途徑中caspase-3和caspase-9凋亡因子的檢測結果，發(fā)現(xiàn)在預注姜黃素后誘導癲癇組的動物海馬中其存活細胞數(shù)目增多，并且凋亡因子caspase-3和caspase-9中的陽性細胞數(shù)目比癲癇組有所減少，證明姜黃素對內(nèi)源性凋亡

13、途徑起到了抑制的作用，有效的抑制了凋亡的發(fā)生，對癲癇所致的海馬神經(jīng)元死亡及丟失起到了保護作用。本研究為姜黃素對癲癇的預防和治療提供了形態(tài)學依據(jù)。 結論： 本研究通過腹腔注射姜黃素的方式采用TUNEL技術、原位雜交等實驗技術觀察了給于不同處理因素的CD-1小鼠腦內(nèi)海馬神經(jīng)元的變化及其之間的相互關系，提示： 1、小鼠在腹腔注射匹羅卡品后不但其行為學發(fā)生變化而且在甲酚紫和TUNEL染色中動物的海馬的CA1區(qū)和CA3區(qū)出