sDR5-Fc對(duì)小鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù).pdf

1、背景：TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosis factorRelatedApoptosis Inducing Ligand，TRAIL)是一種新型腫瘤壞死因子超家族成員之一。在細(xì)胞或組織中如果TRAIL與死亡受體(Death Receptor，DR)結(jié)合，就會(huì)引起炎癥及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，它通常有五個(gè)重要的死亡受體，其中死亡受體4(DR4)和死亡受體(DR5)包含有被認(rèn)為是死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白區(qū)域，這些死亡結(jié)構(gòu)域?qū)τ贒R4和DR5

2、是至關(guān)重要的，它們是傳遞凋亡信號(hào)的重要物質(zhì)。DR4和DR5在配體TRAIL的刺激下與其結(jié)合，進(jìn)而招募具有死亡結(jié)構(gòu)區(qū)的FAS相關(guān)蛋白(Fas-associated Deathdomain，F(xiàn)ADD)，接著FADD招募Procaspase-8和 Procaspase-10等，最終形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(Death Induced Signal Complex， DISC)，隨后Caspase8在Procaspase-8自動(dòng)催化加工下被激活并

3、從DISC釋放，并進(jìn)一步激活Caspase3、Caspase6和Caspase7，且激活的Caspase3會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，TRAIL信號(hào)通路在肺癌、腎癌、肝癌細(xì)胞中的凋亡作用研究已得到了證實(shí)，尤其是在急性腎臟損傷方面已成為研究的熱點(diǎn)。急性腎臟損傷(Acute Kidney Injury，AKI)由多種病因引起的快速腎功能紊亂和高度死亡率為特性的病理綜合征。而缺血再灌注(Ischemia Reperfusion，IR)損傷則是

4、導(dǎo)致AKI的主要原因之一，IR損傷在腎臟的病理學(xué)非常復(fù)雜，很多疾病情況下都可能發(fā)生，具有較高的發(fā)病率，在這一損傷過程中常常伴隨著腎臟細(xì)胞的各種損傷，包括細(xì)胞變性、凋亡、壞死及炎癥細(xì)胞的浸潤等。雖然腎臟移植是近年來迅速發(fā)展的治療腎衰竭病人最有效的治療手段，然而IR損傷則是腎移植不可避免的，研究表明對(duì)IR損傷機(jī)制的研究及干預(yù)有助于減輕IR損傷。因此我們通過構(gòu)建腎臟 IR損傷模型來研究 sDR5-Fc阻斷TRAIL信號(hào)后對(duì)IR損傷的影響，通過

5、檢測(cè)有關(guān)腎臟功能和組織形態(tài)來驗(yàn)證sDR5-Fc對(duì)腎臟是否具有保護(hù)作用，為臨床腎臟移植等手術(shù)提供良好的保護(hù)性藥物。
　　目的：建立腎IR損傷的動(dòng)物模型，檢測(cè)模型中腎功能的血清指標(biāo)，觀察腎組織切片形態(tài)學(xué)的變化和腎細(xì)胞的凋亡，研究TRAIL信號(hào)通路中各相關(guān)蛋白的分布以及基因的變化情況。
　　方法：用健康成年6-8周雄性C57BL/6小鼠通過背部暴露左右兩側(cè)腎臟，分別夾閉左右腎蒂，建立腎臟IR損傷模型。小鼠模型分組情況為：A.Nor

6、mal組，正常飼養(yǎng)不手術(shù)；B. Sham組，只打開背部肌肉暴露腎臟而不缺血；C. PBS組，打開背部皮膚肌肉并且夾閉腎蒂22min使腎臟缺血；D. sDR5-Fc組，打開背部皮膚肌肉并且夾閉腎蒂22min使腎臟缺血，IR后2h和6h腹腔注射sDR5-Fc蛋白，24h時(shí)從心臟采取小鼠血液，分離小鼠血清，通過檢測(cè)各組血清中的BUN與Cr濃度來反應(yīng)小鼠腎臟功能以驗(yàn)證各組腎臟損傷情況，同時(shí)收集腎臟組織，分別于4％多聚甲醛和-80℃保存。分別用T

7、UNEL法和HE染色來觀察腎細(xì)胞凋亡情況和腎組織形態(tài)變化情況，Western Blot確定組織中激活的Cleaved Caspase8的表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)方法來檢測(cè)DR5、TRAIL、CleavedCaspase8和Cleaved Caspase3蛋白的分布與表達(dá)情況，RT-PCR法檢測(cè)DR5和TRAIL蛋白的基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果：通過檢測(cè)小鼠血清中BUN濃度，發(fā)現(xiàn)Sham組與Normal組沒有明顯差異；PBS組較Norm

8、al組和Sham組升高；腹腔注射sDR5-Fc后與PBS組比較BUN濃度下降，同時(shí)檢測(cè)小鼠血清中Cr濃度，發(fā)現(xiàn)各組濃度與BUN濃度結(jié)果一致，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型一和模型二結(jié)果一致。通過HE染色發(fā)現(xiàn)，Normal組和Sham組形態(tài)正常；PBS組腎小管結(jié)構(gòu)被破壞，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，核脫落消失，細(xì)胞從基底膜脫落，但是基底膜處的基底膜輪廓尚存；在 sDR5-Fc組中，上述情況不明顯，損傷區(qū)域減少，明顯少于 PBS組，模型一和模型二結(jié)果一致

9、。TUNEL檢測(cè)腎細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，Normal組與Sham組能觀察到少量綠色熒光點(diǎn)，PBS組綠色熒光點(diǎn)數(shù)量較多，差異顯著，在 sDR5-Fc組，能觀察到綠色熒光點(diǎn)，與PBS組比明顯減少，差異顯著，模型一和模型二結(jié)果一致。免疫組化結(jié)果，分別檢測(cè)DR5、TRAIL、Cleaved Caspase8和Cleaved Caspase3蛋白的分布與表達(dá)，其四種蛋白表達(dá)結(jié)果一致，Normal組和Sham組四種蛋白偶有表達(dá)，PBS組陽性分布較多，sDR

10、5-Fc組陽性分布明顯低于PBS組，模型一和模型二結(jié)果一致。WB結(jié)果顯示TRAIL信號(hào)通路下游分子激活的Cleaved Caspase8在各組內(nèi)均有表達(dá)，PBS組比Normal組和Sham組表達(dá)量較多，sDR5-Fc組比PBS組表達(dá)量降低，模型一和模型二結(jié)果一致。RT-PCR從mRNA水平驗(yàn)證DR5和TRAIL基因的表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)在模型一中對(duì)于DR5基因PBS組比Normal組和Sham組基因變化升高，sDR5-Fc組比PBS組表達(dá)