腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白8樣蛋白2(TIPE2)重組腺病毒抑制胃癌細(xì)胞的作用及其機制.pdf

1、學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。論文作者簽名：腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白8 樣蛋白2 ( T I P E 2 ) 重組腺病毒抑制胃癌細(xì)胞的作用及其機

2、制 中文摘要腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白8 樣蛋白2 ( T I P E 2 ) 重組腺病毒抑制胃癌細(xì)胞的作用及其機制中文摘要目的：研究腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白8 樣蛋白2 ( T I P E 2 ) 對胃癌細(xì)胞的作用及其分子機制。方法：分離人外周血單個核細(xì)胞( P B M C s ) 提取總R N A ，R T - P C R 擴增人T I P E 2c D N A ，將其亞克隆至p M D l 9 ．T 載體進(jìn)行D N A 測序鑒定。以測序正確

3、的p M D l 9 ．T - T I P E 2 為模板，P C R 擴增T I P E 2C D S 片段，在S a i l 、X h o I 酶切位點之間插入至p A d T r a c k ．C M V 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中構(gòu)建p A d T r a c k ．C M V - T I P E 2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，并經(jīng)P C R 、雙酶切、D N A 測序鑒定。將構(gòu)建正確的p A d T r a c k ．C M V - T I P E 2

4、重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒經(jīng)P m e l 單酶切線性化后與p A d E a s y ．1 腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至B J 5 1 8 3 大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，制備腺病毒同源重組質(zhì)粒p A d E a s y - 1 - p A d T r a c k - C M V - T I P E 2( p A d ．T I P E 2 ) 。B J 5 1 8 3 來源的p A d ．T I P E 2 再轉(zhuǎn)化至T o p l 0 大腸桿菌進(jìn)行擴增，然后

5、P a c I 單酶切回收大片段用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染2 9 3 正常人胚腎細(xì)胞進(jìn)行T I P E 2 重組腺病毒( A d V T I P E 2 ) 包裝。A d V T I P E 2 在2 9 3 細(xì)胞中多輪感染和擴增，并用氯化銫( C s C I )密度梯度超速離心純化。R T - P C R 檢測A G S 、H G C 2 7 、S G C ．7 9 0 1 人胃癌細(xì)胞和G E S ．1正常人胃粘膜上皮細(xì)胞中內(nèi)源性T I P E 2

6、 的表達(dá)；R T - P C R 和W e s t e r nb l o t 檢測A d V T I P E 2 重組腺病毒介導(dǎo)的T I P E 2 在2 9 3 和A G S 細(xì)胞中的表達(dá)。分別利用M T T 、A n n e x i n V - P E ／7 ．A A D 雙染的流式分析、劃痕實驗、T r a n s w e l l 侵襲實驗檢測腺病毒介導(dǎo)的T I P E 2 表達(dá)對A G S 胃癌細(xì)胞生長、凋亡、移動和侵襲能力的影

7、響，并W e s t e r n b l o t檢測對B c l - 2 、B c l —X L 、，B a x 、B a k 、C a s p a s e 一9 、C a s p a s e - 3 、P A R P 、p - E R K l ／2 、E R K l ／2 、p - A K T ，A K T ，P —G S K 3 1 B ，G S K 3 1 3 ，E —c a d h e r i n 、N —c a d h e r

8、 i n 、V i m e n t i n 、S n a i l l ，S n a i l 2 ／S l u g ，T w i s t 、Z e b l 蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：( 1 ) 從外周血單個核細(xì)胞( P B M C s ) 中成功克隆出特異性的6 8 4 b p 人T I P E 2c D N A ( 含有5 5 5 b p C D S ) ，亞克隆至p M D l 9 - T v e c t o r 中測序與G e n B