腫瘤壞死因子-a誘導(dǎo)心肌肥大的Ca2+信號通路研究.pdf

1、目的：
　　 心肌肥大是指心肌細(xì)胞體積增大而無細(xì)胞分裂，其特征是心臟體積增大和蛋白質(zhì)合成率增加。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是一具有多種生物學(xué)效應(yīng)的炎癥性細(xì)胞因子，主要由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，心肌細(xì)胞也可產(chǎn)生。在內(nèi)毒素的刺激下心臟心肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞幾乎產(chǎn)生同樣多的TNF-α。目前研究表明，感染和內(nèi)毒素血癥是心臟產(chǎn)生TNF-α的重要刺激因素，TNF-α，的局部升高可直接影響心

2、功能，并參與多種心臟疾病如充血性心力衰竭、心肌炎、缺血性心臟病的病理生理過程。研究證明TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大性反應(yīng)。但是，TNF-α，誘導(dǎo)心肌肥大的分子機(jī)制尚未完全闡明。大量研究表明：胞內(nèi)Ca2+信號的改變是肥厚反應(yīng)的首要刺激，在心臟肥厚和基因表達(dá)中發(fā)揮中心作用，其通過激活下游的酶來發(fā)揮第二信使的功能。目前認(rèn)為有兩種鈣介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制參與了心肌肥厚的發(fā)生與發(fā)展：一是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)介導(dǎo)途徑；二是鈣調(diào)素依

3、賴性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin dependent kinaseⅡ，CaMKⅡ)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究以體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞為模型，探討TNF-α對心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響以及Ca2+在TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大中的作用；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討Ca2+下游兩個重要的鈣調(diào)節(jié)酶CaMKⅡ和CaN在TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大中的作用，以揭示TNF-α，誘導(dǎo)心肌肥大的信號通路。
　　 研究表明：磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidy

4、linositol3-kinase，PI3K)參與心肌細(xì)胞Ca2+信號的調(diào)節(jié)。而PI3K在心肌肥厚發(fā)生中起到重要作用。有報(bào)道：PI3K-Akt/PKB途徑的激活在TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白合成增加中起到重要作用。那么TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大中激活的PI3K是否參與了[Ca2+]i的調(diào)節(jié)以及Ca2+/CaMK/CaN信號通路與PI3K途徑是否有關(guān)聯(lián)？本課題將從細(xì)胞水平及分子水平對上述內(nèi)容進(jìn)行研究探討。
　　 方法：
　　

5、第一部分：
　　 1、觀察TNF-α，不同濃度和不同作用時間對培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞蛋白含量的影響
　　 采用Lowry's法測定蛋白質(zhì)含量。分為對照組和濃度(μg/L)為10、20、50、100、200的TNF-α組，繼續(xù)培養(yǎng)72h后進(jìn)行蛋白含量的測定，摸索TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大的量效曲線，選擇最佳作用濃度。
　　 分為對照組和濃度為100μg/L的TNF-α實(shí)驗(yàn)組，繼續(xù)培養(yǎng)0、12、24、48、72和96h后進(jìn)行蛋

6、白含量的測定。探討TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大的時效曲線，選擇最佳作用時間。
　　 2、觀察TNF-α，對培養(yǎng)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響
　　 采用兩個測定指標(biāo)：一是利用熒光指示劑Fura-2測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變；二是應(yīng)用Fluo-3/AM熒光標(biāo)記技術(shù)及共聚焦顯微鏡檢測單個心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化。觀察100μg/L TNF-α對心肌[Ca2+]i的影響，并進(jìn)一步應(yīng)用IP3R拮抗劑2-APB、RyR拮抗劑ryanodin

7、e以及L型Ca2+通道阻斷劑nifedipine等工具藥觀察TNF-α，誘導(dǎo)培養(yǎng)心肌細(xì)胞[Ca2+]i增加的來源及途徑。Ca2+瞬變測定共設(shè)6組，①對照組；②TNF-α(100μg/L)組；③IP3R阻斷劑2-APB(30μM)+TNF-α，(100μg/L)組；④RyR阻斷劑ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)組：⑤L型Ca2+通道阻斷劑nifedipine(50μM)+TNF-α(100μg/L)組；⑥IP3

8、R阻斷劑2-APB(30μM)+RyR阻斷劑ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)組。上述阻斷劑預(yù)孵育30min后上機(jī)測定。先記錄一段基礎(chǔ)值，觀察各阻斷劑對正常心肌細(xì)胞[Ca2+]i瞬變有無影響；再加入TNF-α(100μg/L)，觀察TNF-α刺激前后鈣瞬變的變化。
　　 3、觀察IP3R阻斷劑2-APB、RyR阻斷劑ryanodine以及L型Ca2+通道阻斷劑nifedipine對TNF-α，誘導(dǎo)心肌肥

9、大的影響
　　 共設(shè)9組：①對照組；②TNF-α(100μg/L)組；③IP3R阻斷劑2-APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)組；④RyR阻斷劑ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)組：⑤L型Ca2+通道阻斷劑nifedipine(50μM)+TNF-α(100μg/L)組；⑥IP3R阻斷劑2-APB(30μM)+RyR阻斷劑ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)組：⑦2-

10、APB(30μM)組：⑧ryanodine(50μM)組；⑨nifedipine(50μM)組。給藥72 h后分別進(jìn)行肥大指標(biāo)測定，包括蛋白含量、蛋白合成及細(xì)胞體積。采用Lowry's法測定蛋白質(zhì)含量，采用同位素示蹤[3H]-leucine摻入法測定蛋白合成，通過計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)測定心肌細(xì)胞體積。
　　 第二部分：
　　 1、觀察CaMKⅡ和CaN在TNF-α，誘導(dǎo)的心肌肥大中的作用
　　 實(shí)驗(yàn)共設(shè)6組：①對照

11、組：②TNF-α(100μg/L)組：③CaMK阻斷劑KN93(0.2μmol/L)+TNF-α(100μg/L)組：④CaN阻斷劑CsA(0.2μmol/L)+TNF-α，(101μg/L)組：⑤CaMK阻斷劑KN93(0.2μmol/L)組：⑥CaN阻斷劑CsA(0.2μmol/L)組。阻斷劑較TNF-α提前30min加入。給藥72h后進(jìn)行蛋白含量、蛋白合成及細(xì)胞體積的測定。測定方法同前。
　　 2、檢測TNF-α，對心肌細(xì)

12、胞CaMKⅡδB和CaN蛋白表達(dá)的影響
　　 應(yīng)用Western blot法測定心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡδB和CaN蛋白表達(dá)。分為2組：①對照組：②TNF-α(100μg/L)組。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48h/72h后收集細(xì)胞，測定。
　　 第三部分：
　　 1、觀察PI3K對TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞[Ca2+]i變化的影響
　　 應(yīng)用Till陽離子測定系統(tǒng)測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變以及應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測單個心肌細(xì)

13、胞內(nèi)Ca2+濃度變化。Ca2+瞬變測定設(shè)8組：①對照組；②TNF-α(100μg/L)組；③2-APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)；④ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)：⑤2-APB(30μM)+ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)；⑥LY294002(50μM)+TNF-α(100μg/L)；⑦LY294002(50μM)+2-APB(30μM)+TNF-α(100μg/

14、L)：⑧LY294002(50μM)+ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)。先記錄一段基礎(chǔ)值，觀察各阻斷劑對正常心肌細(xì)胞[Ca2+]i瞬變有無影響；再加入TNF-α(100μg/L)，觀察TNF-α刺激前后鈣瞬變的變化。
　　 激光共聚焦顯微鏡檢測共設(shè)5組：①對照組；②TNF-α(100μg/L)組：③PI3K阻斷劑LY294002(50αM)+TNF-α(100μg/L)；④PI3K阻斷劑LY29400

15、2(50μM)+IP3R阻斷劑2-APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)；⑤PI3K阻斷劑LY294002(50μM)+RyR阻斷劑ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)組。上述阻斷劑預(yù)孵育30min后上機(jī)測定。先記錄一段基礎(chǔ)值后，再加入TNF-α(100μg/L)，觀察TNF-α刺激前后[Ca2+]i的變化。
　　 2、觀察PI3-K對TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大的影響
　　 共設(shè)7組：①對照

16、組：②TNF-α(100μg/L)：③IP3R阻斷劑2APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)組：④PI3-K阻斷劑LY294002(50μM)+TNF-α(100μg/L)組：⑤PI3-K阻斷劑LY294002(50μM)+IP3R阻斷劑2APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)組：⑥PI3-K阻斷劑LY294002(50μM)+RyR阻斷劑ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)組；⑦PI3-K阻

17、斷劑LY294002(50μM)。各阻斷劑均在TNF-α加入前30min加入。給藥72h后分別進(jìn)行蛋白含量、蛋白合成及細(xì)胞體積的測定。測定方法同前。
　　 3、觀察PI3K對TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞CaMKⅡδB和CaN表達(dá)的影響
　　 分為4組：①對照組；②TNF-α(100μg/L)；③PI3K阻斷劑LY294002(50μM)+TNF-α(100μg/L)組；④PI3K阻斷劑LY294002(50μM)+IP3R阻斷

18、劑2-APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)組。給藥48/72h后收集細(xì)胞，應(yīng)用Western blot法測定心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡδB/CaN蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：
　　 1、TNF-α，不同濃度及不同作用時間對培養(yǎng)心肌細(xì)胞蛋白含量的影響
　　 TNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞蛋白含量增加，在10～100μg/L濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性；在12～72 h內(nèi)呈時間依賴性。
　

19、　 2、TNF-α對培養(yǎng)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響
　　 TNF-α(100μg/L)誘導(dǎo)心肌內(nèi)鈣離子濃度增高(P<0.01)。IP3R阻斷劑2-APB(30μmol/L)和/或RyR阻斷劑ryanodine(50μmol/L)明顯抑制上述反應(yīng)，且二者合用抑制作用更明顯。L型Ca2+通道阻斷劑nifedipine(50μmol/L)對TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高無明顯影響(P>0.05)。各阻斷劑對正常心肌細(xì)胞鈣離

20、子濃度無明顯影響。
　　 3、2-APB、ryanodine以及nifedipine對TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用
　　 IP3R阻斷劑2-APB(30μmol/L)和/或RyR阻斷劑ryanodine(50μmol/L)明顯抑制TNF-α(100μg/L)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成以及細(xì)胞體積的增加(P<0.01)。L型Ca2+通道阻斷劑nifedipine(50μmol/L)對TNF-α(100μg/L)

21、誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成以及細(xì)胞體積的增加無明顯影響(P>0.05)。上述阻斷劑對正常心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成及細(xì)胞體積無明顯影響(P>0.05)。
　　 第二部分：
　　 1、CaMKⅡ和CaN對TNF-α，誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響
　　 CaMKⅡ抑制劑KN93(0.2μmol/L)或CaN抑制劑CsA(0.2μmol/L)明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成量以及細(xì)胞體積的增加(P<

22、0.01)。CaMKⅡ抑制劑KN93(0.2μmol/L)和CaN抑制劑CsA(0.2μmol/L)對『F常心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成及細(xì)胞體積無明顯影響(P>0.05)。
　　 2、TNF-α對心肌細(xì)胞CaMKⅡδB和CaN表達(dá)的影響
　　 TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞CaMKⅡδB和CaN表達(dá)顯著增加(P<0.01)。
　　 第三部分：
　　 1、PI3K對TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高的影響

23、r>　　 PI3K阻斷劑LY294002(50μM)明顯抑制TNF-α(100μg/L)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高(P<0.01)，對正常心肌細(xì)胞[Ca2+]i無明顯影響。其抑制作用與LY294002+2-APB組相近(P>0.05)，小于LY294002+ryanodine組(P<0.05)。
　　 2、PI3K對TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大的作用
　　 LY294002(50μM)明顯抑制TNF-α(100μg/L)

24、誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成及細(xì)胞體積的增加(P<0.01)；其抑制程度與LY294002(100μM)+2-APB(30μM)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但明顯大于2-APB(30μM)組，小于LY294002+ryanodine(50μM)組。LY294002(50μM)對正常心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成及細(xì)胞體積無明顯影響(P>0.05)。
　　 3、PI3K對TNF-α，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞CaMKⅡδB和CaN表達(dá)的影響<

25、br>　　 PI3K阻斷劑LY294002(50μM)明顯抑制TNF-α(100μg/L)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞CaMKⅡδB和CaN表達(dá)增加(P<0.01)，其抑制程度與LY294002+2-APB(30μM)組相近(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、TNF-α通過作用IP3R和RyR而非打開L型Ca2+通道引起胞內(nèi)鈣離子濃度增加，從而誘導(dǎo)心肌肥大。
　　 2、TNF-α誘導(dǎo)的心肌肥大與CaMKⅡδB和CaN