腦慢性低灌注對白質功能影響及相關分子機制研究.pdf

1、腦慢性低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)可以導致腦缺血缺氧，與血管性癡呆及老年相關疾病如阿爾茲海默氏病等多種疾病相關。既往認為白質對缺血具有很高的耐受性，但越來越多的研究表明，腦白質對慢性缺血缺氧的敏感性遠高于皮質，特別是富含髓鞘的白質，易引起脫髓鞘，導致軸突的不可逆損害。這可能是認知障礙等腦功能減退的關鍵結構基礎。
　　研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能的缺失與供應腦實質的深穿支小動脈以及頸部大動脈及其

2、顱內(nèi)分支動脈有密切聯(lián)系，當動脈發(fā)生病變或者狹窄時會導致大腦半球深部白質部分血流量下降，持續(xù)性的灌流不足可造成白質疏松，從而引起神經(jīng)功能的缺失，產(chǎn)生具有臨床意義的神經(jīng)癥狀。腦慢性低灌注導致白質損傷的分子機制缺乏清楚認識。
　　郎飛結(Ranvier node)的近結側區(qū)(juxtaparanode region)粘附分子變化對髓鞘及軸突功能可產(chǎn)生明顯作用;在膠質與軸突相互作用中，細胞粘附分子起著重要的聯(lián)系作用，而膠質/軸突界面變化可

3、引起軸突變性。Caspr2(Contactin-associated protein-2)在軸突與膠質細胞間發(fā)生粘附作用，參與構成有髓神經(jīng)纖維近結側區(qū)，其病變可抑制軸突與膠質細胞的相互作用，繼而減慢神經(jīng)傳導速度和改變髓鞘結構，在介導正常髓鞘板層形成及神經(jīng)沖動的跨節(jié)跳躍傳導起關鍵作用。Caspr2結構變化還可引起結區(qū)Na+通道、近結側區(qū)K+通道的界限消失，導致白質功能變化。Caspr2在腦慢性低灌注狀態(tài)下白質損害的作用沒有得到研究和認識。

4、所以，本研究在慢性低灌注下，首先觀察白質功能改變，包括傳導功能、突出運輸功能和細胞骨架變化，再進一步探討Caspr在白質改變中的作用及對離子通道的影響，探討腦慢性低灌注下白質改變的分子機制。
　　本研究對SD大鼠進行雙側頸總動脈部分狹窄手術建立腦慢性低灌注模型，通過HE染色、電鏡觀察各組大鼠腦組織的形態(tài)學變化，證明符合缺血性改變;利用運動誘發(fā)電位方法檢測各組大鼠（對照組及術后2周、4周、12周）的軸突傳導功能;采用免疫組織化學方法

5、檢測慢性缺血大鼠海馬CA1區(qū)蛋白NF200和Aβ1-40的變化情況;運用免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡及western blot方法觀察各組大鼠胼胝體區(qū)Caspr2和Na+通道變化情況。對腦慢性低灌注下白質改變的分子機制進行了初步研究和探討，其結果可能對臨床慢性腦缺血導致的腦損傷、認知減退等多種疾病的防治具有重要指導作用。
　　本研究共分三部分:
　　一、腦慢性低灌注動物模型的構建及對腦組織形態(tài)學的評價
　　1.方法

6、>　　在無菌技術條件下，利用針線法對SD大鼠的行頸正中切口，分離出雙側頸總動脈。放置注射針頭(直徑約為1.2mm)于距頸內(nèi)外動脈交接1.5cm處，用絲線固定頸總動脈與針頭，使大鼠雙側頸總動脈部分狹窄，使其出現(xiàn)血流灌注減少，最終形成慢性低灌注，程度可控;維持低灌注狀態(tài)后2周、4周以及12周，通過HE染色，光鏡觀察各組大鼠腦組織的形態(tài)學變化，證明符合缺血性改變;
　　2.結果
　　(1)慢性腦灌注不足大鼠模型，除麻醉意外，無死亡

7、，穩(wěn)定性和可重復性良好，低灌注程度效果穩(wěn)定、可靠;
　　(2)大鼠雙側頸總動脈部分結扎后，大腦海馬區(qū)錐體細胞經(jīng)歷了從最初的缺血、水腫，逐漸發(fā)展形成核染色淺淡、嚴重的神經(jīng)元脫失和微空泡。這種變化符合慢性持續(xù)性腦血流量下降的病理表現(xiàn)，適合腦慢性低灌注實驗研究。
　　二、腦慢性低灌注狀態(tài)下觀察白質功能改變，包括傳導功能、運輸功能和細胞骨架變化
　　1.方法
　　采用運動誘發(fā)電位檢測各實驗組大鼠的運動誘發(fā)電位潛伏期變化，

8、觀察白質傳導功能改變;采用免疫組織化學方法檢測大鼠海馬CA1區(qū)Aβ1-40和NF200蛋白表達和分布的變化，了解傳輸功能改變。
　　2.結果
　　(1)白質傳導功能改變:在腦慢性低灌注狀態(tài)下2周、4周以及12周MEP潛伏期顯著延長，并隨低灌注狀態(tài)的維持，MEP潛伏期延長更為明顯，表明腦慢性低灌注導致的腦缺血時軸索傳導功能受損，隨著低灌注時間推移其傳導功能加重惡化。
　　(2)傳輸功能改變:實驗觀察到對照組大鼠腦內(nèi)海馬C

9、A1區(qū)很少有Aβ1-40表達，但NF200表達很明顯。腦缺血2周，海馬CA1區(qū)出現(xiàn)Aβ1-40免疫染色陽性細胞，染色較淺，NF200表達比對照組減弱。腦缺血4周，海馬CA1區(qū)出現(xiàn)較多的Aβ1-40免疫染色陽性細胞;NF200表達比腦缺血2周組時還要減弱。腦缺血12周，海馬CA1區(qū)Aβ1-40免疫染色陽性細胞進一步增多;NF200表達仍在減少。結果顯示慢性腦灌注不足時軸突傳輸功能受損，Aβ1-40不能通過軸突輸送至遠端而在胞體聚集，作為細

10、胞骨架蛋白NF200表達降低會導致軸突損害和傳輸功能改變、軸突變性。
　　三、腦慢性低灌注狀態(tài)下觀察Caspr2、Na+通道蛋白表達變化
　　1.方法
　　采用免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡技術觀察粘附分子Caspr2的變化、western blot方法檢測Na+通道蛋白表達。
　　2.結果
　　采用免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡技術觀察Caspr2在腦慢性低灌注后表達減少，陽性細胞數(shù)及染色強度均顯著下降，隨著低灌

11、注持續(xù)時間越長呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，同時Caspr2的分布模式也發(fā)生明顯改變，縱行條點狀纖維走行出現(xiàn)紊亂，在12周時局部區(qū)域出現(xiàn)Caspr2陽性顆粒聚集成團現(xiàn)象。利用western blot方法檢測到Na+通道蛋白也有同樣進行性下降趨勢。提示粘附分子Caspr2在腦慢性低灌注時存在表達變化，Na+通道蛋白表達也降低，Na+通道蛋白表達降低引起Na+內(nèi)流減弱，影響傳導功能。Caspr2這種變化可能是髓鞘分離及髓鞘脫失、Na+通道蛋白表達降低及

12、傳導功能減退的重要原因。
　　本研究主要結論如下:
　　采用雙側頸總動脈部分狹窄的方法建立腦慢性低灌注模型，是研究腦白質缺血性損傷病理機制和治療的較為理想的動物模型之一。腦慢性低灌注影響軸突傳導、傳輸功能。運動誘發(fā)電位出現(xiàn)隨著缺血時間延長而逐漸延長的趨勢;Aβ1-40在胞體聚集，不能傳輸至軸突遠端;NF200表達下降影響軸突結構和傳輸功能。白質功能改變可能與Caspr2表達降低及分布異常、Na+通道蛋白表達下降有關。粘附分子