Id1通過(guò)上調(diào)Wnt2表達(dá)調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞周期的研究.pdf

1、目的：
　　動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素之一是血管內(nèi)皮層結(jié)構(gòu)損傷和（或）功能障礙。所以維持血管內(nèi)皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)及功能的完整性是預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的重要環(huán)節(jié)。骨髓中存在一種血管內(nèi)皮前體細(xì)胞～內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，可動(dòng)員被釋放入外周血后歸巢到血管內(nèi)皮損傷部位參與再內(nèi)皮化，發(fā)揮其血管損傷修復(fù)的功能。但是，EPCs在外周血中數(shù)量極其有限，有限的數(shù)量是制約EPCs發(fā)揮內(nèi)皮損傷修復(fù)功能的

2、重要因素。因此，增加EPCs外周血含量成為目前研究熱點(diǎn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)DNA結(jié)合抑制因子-1(Inhibitor of DNA binding1，Id1)在促進(jìn)EPCs增殖方面起著重要作用。但是，Id1促進(jìn)EPCs增殖的具體分子機(jī)制尚不完全清楚。
　　Id1是螺旋環(huán)螺旋(helix-loop-helix，HLH)家族成員之一，參與細(xì)胞增殖、遷移、分化等多種細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)程。在腫瘤細(xì)胞中Id1可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclin

3、 D1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期演進(jìn)。細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，Id1是否調(diào)控EPCs細(xì)胞周期尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。另外，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Id1基因敲除小鼠的肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞中Wnt2顯著減少，且肝血管再生功能缺失，外源性的Wnt2能夠恢復(fù)其肝血管再生的功能。Wnt2參與血管生成，并在干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用。而細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclin D1正是Wnt/β-Catenin信號(hào)通路的經(jīng)典下游靶點(diǎn)。

4、因此，提出假設(shè)Id1能通過(guò)Wnt2作用于EPCs細(xì)胞周期調(diào)控。
　　本研究通過(guò)探討Id1在EPCs細(xì)胞周期調(diào)控中的作用及可能機(jī)制，為研究Id1調(diào)控EPCs增殖的分子機(jī)制提供了新思路。
　　方法：
　　1.小鼠骨髓源性EPCs分離培養(yǎng)與鑒定
　　1.1小鼠骨髓源性EPCs分離培養(yǎng)
　　我們利用密度梯度離心法，從小鼠脛骨和股骨中提取骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞，并接種在明膠包被的培養(yǎng)瓶中，給予含20％胎牛血清的DMEM-

5、F12培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時(shí)后，棄除未貼壁細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4-7天。
　　1.2 EPCs鑒定
　　1.2.1倒置顯微鏡下觀察EPCs形態(tài)學(xué)特點(diǎn);
　　1.2.2給予Dil-Ac-LDL及FITC-UEA-1孵育，然后給予DAPI孵育后進(jìn)行共聚焦熒光鏡檢測(cè)熒光雙染率;
　　1.2.3向待鑒定細(xì)胞中分別加入抗小鼠Sca-1和VEGFR2抗體，用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型。
　　2.Id1對(duì)EPCs細(xì)

6、胞周期的影響
　　2.1過(guò)表達(dá)外源性Id1對(duì)EPCs細(xì)胞周期的影響
　　過(guò)表達(dá)Id1重組腺病毒轉(zhuǎn)染EPCs，用RT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)待檢細(xì)胞的細(xì)胞周期分布;用RT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期因子Cyclin D1的表達(dá)情況。
　　2.2干擾內(nèi)源性Id1表達(dá)對(duì)EPCs細(xì)胞周期的影響
　　siRNA轉(zhuǎn)染EPCs，用RT-PCR和Western blot檢

7、測(cè)干擾內(nèi)源性Id1表達(dá)的效率。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)待檢細(xì)胞的細(xì)胞周期分布;用RT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期因子Cyclin D1的表達(dá)情況。
　　3.Wnt2在Id1對(duì)EPCs細(xì)胞周期調(diào)控中的作用。
　　3.1過(guò)表達(dá)外源性Id1對(duì)Wnt2表達(dá)及β-Catenin細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的影響
　　提取過(guò)表達(dá)Id1重組腺病毒轉(zhuǎn)染后的EPCs中總RNA、總蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核蛋白，用RT-PCR和Western bl

8、ot檢測(cè)Wnt2表達(dá)情況及β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量的變化。
　　3.2干擾內(nèi)源性Id1表達(dá)對(duì)Wnt2表達(dá)及β-Catenin細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的影響
　　提取siRNA轉(zhuǎn)染后的EPCs中總RNA、總蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核蛋白，用RT-PCR和Western blot檢測(cè)Wnt2表達(dá)情況及β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量的變化。
　　3.3干擾Wnt2表達(dá)對(duì)Id1調(diào)控EPCs細(xì)胞周期的影響
　　用

9、siRNA轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Id1的EPCs，干擾Wnt2表達(dá)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)待檢細(xì)胞的細(xì)胞周期分布;用RT-PCR和Western blot檢測(cè)Id1、Wnt2及Cyclin D1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.Id1對(duì)EPCs細(xì)胞周期的影響
　　1.1小鼠骨髓源性EPCs分離培養(yǎng)與鑒定
　　骨髓單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)4-7天后可觀察到大量梭形、橢圓形、紡錘形細(xì)胞。Dil-Ac-LDL及FITC-UEA-1熒光雙染鑒定

10、，在激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)，貼壁細(xì)胞中，細(xì)胞核攝取DAPI后呈藍(lán)色熒光，（91.4±2.0）％呈紅、綠熒光雙染，該雙染細(xì)胞即為EPCs。利用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)Sca-1和VEGFR-2在待測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)情況，結(jié)果顯示:Sca-1陽(yáng)性率為90.6％，VEGFR-2陽(yáng)性率為94％。
　　1.2 Id1對(duì)EPCs細(xì)胞周期的影響
　　1.2.1過(guò)表達(dá)外源性Id1促進(jìn)EPCs細(xì)胞周期的演進(jìn)
　　流式細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染對(duì)

11、照組或Ad-vector轉(zhuǎn)染組比較，Ad-Id1轉(zhuǎn)染組的EPCs中處于G1期的細(xì)胞數(shù)顯著減少，處于S/G2M期的細(xì)胞數(shù)顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示Ad-Id1能促進(jìn)EPCs細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S/G2M期。同時(shí)，RT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期因子Cyclin D1的mRNA和蛋白含量，結(jié)果顯示Ad-Id1轉(zhuǎn)染組中Cyclin D1的mRNA和蛋白含量均顯著高于對(duì)照組。以上提示:Id1能促進(jìn)EPCs

12、細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期。
　　1.2.2干擾內(nèi)源性Id1表達(dá)抑制EPCs細(xì)胞周期的演進(jìn)
　　流式細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組或si-con轉(zhuǎn)染組比較，si-Id1轉(zhuǎn)染組的EPCs中處于G1期的細(xì)胞數(shù)顯著增多，處于S/G2M期的細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示si-Id1能抑制EPCs細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S/G2M期。同時(shí)，RT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期因子Cyclin D1的m

13、RNA和蛋白含量，結(jié)果顯示si-Id1轉(zhuǎn)染組中Cyclin D1的mRNA和蛋白含量均顯著低于對(duì)照組。以上提示:干擾Id1表達(dá)能抑制EPCs細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期。
　　2.Id1通過(guò)上調(diào)Wnt2表達(dá)調(diào)控EPCs細(xì)胞周期。
　　2.1過(guò)表達(dá)外源性Id1促進(jìn)Wnt2表達(dá)及β-Catenin細(xì)胞核轉(zhuǎn)移
　　RT-PCR和Western blot檢測(cè)Wnt2的mRNA和蛋白含量，結(jié)果顯示Ad-Id1轉(zhuǎn)染組中Wnt2的mRN

14、A和蛋白含量均顯著高于對(duì)照組。Western blot檢測(cè)β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量，結(jié)果顯示Ad-Id1轉(zhuǎn)染組中β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量均顯著高于對(duì)照組。提示Ad-Id1可促進(jìn)EPCs中Wnt2表達(dá)，及促進(jìn)β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)中聚集并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　2.2干擾內(nèi)源性Id1表達(dá)抑制Wnt2表達(dá)及β-Catenin細(xì)胞核轉(zhuǎn)移
　　RT-PCR和Western blot檢測(cè)Wnt2的mR

15、NA和蛋白含量，結(jié)果顯示si-Id1轉(zhuǎn)染組中Wnt2的mRNA和蛋白含量均顯著低于對(duì)照組。Western blot檢測(cè)β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量，結(jié)果顯示si-Id1轉(zhuǎn)染組中β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量均顯著低于對(duì)照組。提示si-Id1可抑制EPCs中Wnt2表達(dá)，及抑制β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)中聚集及向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　2.3干擾Wnt2表達(dá)拮抗Id1對(duì)EPCs細(xì)胞周期的調(diào)控作用
　　流式細(xì)胞

16、周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ad-Id1/si-Wnt2組EPCs中G1期細(xì)胞比例較Ad-Id1/si-con組顯著升高，但低于Ad-vector/si-con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)，RT-PCR和Western blot檢測(cè)Cyclin D1的mRNA和蛋白含量，結(jié)果顯示Ad-Id1/si-Wnt2組中Cyclin D1的mRNA和蛋白含量均顯著低于Ad-Id1/si-con組，但高于Ad-vector/si-con組。提示W(wǎng)n