轉錄因子Id1對內皮祖細胞增殖、遷移的影響及在損傷血管修復中作用的研究.pdf

1、1.背景與目的:
　　 血管內皮損傷是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、介入治療后再狹窄等多種血管性疾病共同的病理生理基礎,盡早促進受損血管再內皮化、恢復內皮功能為抑制血管損傷不良修復、預防或防治血管再狹窄及血栓形成的有效策略。因此,揭示內皮再生機理,促進內皮細胞有益再生是損傷性血管疾病治療中亟待解決的問題。既往認為血管損傷主要依靠損傷部位鄰近的內皮細胞再生修復,但病損情況下鄰近內皮的增殖能力有限。近年研究顯示除了血管損傷局部附近內

2、皮細胞再生外,不同來源的血管前體細胞同樣是參與損傷內皮修復的重要力量。業(yè)已證實,內皮前體細胞即所稱的內皮祖細胞(Endothelial precusor cells,EPCs),能“歸巢”于血管損傷處定向分化為內皮細胞并通過旁分泌機制促進內皮修復和血管新生。然而,目前對于調控EPCs增殖、遷移等生理功能的機制或某些關鍵因子在其中的作用尚不完全清楚。
　　 分化抑制因子屬于螺旋-環(huán)-螺旋(Helix-loop-helix,HLH)

3、轉錄因子家族,Id包括Id1-Id4四個亞型,各成員均包括高度保守的HLH結構區(qū),但缺乏堿性DNA結合區(qū)。Id與其他堿性HLH蛋白(如E2A,E12,E47,c-Myc)形成異二聚體,從而抑制了這些堿性HLH蛋白與DNA及其他組織特異性堿性LHL轉錄因子結合,影響特異性蛋白的表達,抑制細胞分化。目前發(fā)現(xiàn),Id參與了包括表皮、肌肉、神經(jīng)等多種類細胞增殖分化及及腫瘤形成,且Id1與骨髓EPCs動員等密切相關,但Id是否也對EPCs功能有調控

4、作用并參與血管損傷修復尚不清楚。研究結果發(fā)現(xiàn):①Id與血管系統(tǒng)發(fā)生密切相關,胚胎發(fā)育中Id1-Id4表達呈復雜的時空模式,但Id1、Id3廣泛表達且重疊貫穿整個胚胎腦血管系統(tǒng),Id1/Id3雙基因敲除小鼠由于明顯的血管畸形、分叉障礙導致胚胎E13.5期死亡;②Id參與腫瘤血管新生:Id在內皮細胞過表達導致血管新生,缺失導致促血管生成基因如FGFR-1的下調,而野生型骨髓內皮前體細胞高表達Id1、Id3,移植后摻合到腫瘤血管床參與血管新生

5、,且Id1、Id3陽性表達與血管密度顯著正相關;③體外細胞實驗中,Id能促進人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的增殖、激活及管樣形成,促血管生長因子VEGF、TGF-β則誘導HUVEC及骨髓源EPCs表達Id1和Id3,提示Id1、Id3可能是VEGF等促血管生長作用的下游關鍵靶點。研究結果提示:Id1可能表達于EPCs,并有調控其增殖、血管新生的功效,推測Id1為決定EPCs增殖的一類開關基因,受上游特殊信號刺激Id1的表達左右著增殖重要

6、基因的轉錄,在EPCs介導的血管損傷修復中發(fā)揮重要作用。
　　 在本課題中,我們將分別從細胞及在體動物水平探討Id1在EPCs增殖、遷移以及血管損傷修復中的作用。為研究EPCs生理功能的調控機制及EPCs在血管損傷修復中的作用提供實驗依據(jù),為深入探討促進血管損傷后內皮有益再生提供新的思路。
　　 2.方法:
　　 2.1重組腺病毒Ad-Id1的構建
　　 由大鼠組織中提取RNA,經(jīng)RT-PCR擴增得到目的

7、基因Id1片段,經(jīng)pMD19T-Simple和AdEasy細菌內同源重組系統(tǒng)構建Id1的病毒過表達載體,即Ad-Id1,通過測序、PCR和酶切鑒定重組病毒Ad-Id1的構建。
　　 2.2 Id1對EPCs增殖、遷移功能的影響
　　 用密度梯度離心法及選擇性培養(yǎng)的方法,體外分離、培養(yǎng)小鼠脾源性EPCs,通過細胞形態(tài)學、表面分子標志以及Dil-acLDL/FITC-UEA-I雙陽性等方法進行鑒定;轉染Ad-Id1以及si-

8、RNA-Id1,觀察過表達或沉默Id1基因對EPCs增殖、遷移的作用。
　　 2.3觀察Id1在血管損傷后局部血管壁的表達及參與血管損傷修復過程的作用
　　 用體重為20g-30g的雄性昆明小鼠復制頸動脈損傷模型,通過熒光定量RT-PCR以及Western blot分別觀察Id1在血管損傷修復過程中mRNA和蛋白表達水平的變化;將過表達Id1的EPCs注入頸動脈損傷小鼠尾靜脈,14d后觀察損傷血管局部再內皮化及新生內膜增

9、殖程度。
　　 3.結果:
　　 3.1重組腺病毒Ad-Id1的構建
　　 由大鼠組織提取RNA,進行RT-PCR獲得含酶切位點的Id1基因全CDS區(qū),將目的基因連接到pMD19T-Simple載體中進行擴增,經(jīng)酶切、連接、轉化等步驟后得到pAdTrack-Id1,與骨架質粒pAdEasy-1在BJ5183細菌內進行同源重組,通過篩選、293T細胞包裝后獲得重組病毒Ad-Id1,經(jīng)鑒定、擴增獲得高滴度的Ad-Id

10、1病毒顆粒以用于下一步的實驗。Ad-Id1的病毒滴度約為1.2×1010-2.8×1011 pfu/ml。
　　 3.2 Id1對體外培養(yǎng)脾源性EPCs增殖、遷移功能的影響
　　 3.2.1脾源性EPCs鑒定
　　 分離培養(yǎng)的脾源性EPCs經(jīng)過誘導分化后向內皮細胞表型轉變,流式細胞檢測Scal-1、VEGFR-2在培養(yǎng)細胞中的陽性率分別為83.5％、57.6％,Dil-acLDL/FITC-UEA-I雙陽性細胞約

11、占90％,說明所培養(yǎng)脾源性細胞是EPCs。
　　 3.2.2 Id1在脾源性EPCs的表達情況
　　 Id1在脾源性EPCs呈低水平表達,而當受到血清或VEGF刺激后,Id1的基因及蛋白水平均明顯增高;靜止狀態(tài)下ld1定位表達于EPCs細胞漿內。
　　 3.2.3基因轉染脾源性EPCs
　　 轉染后細胞狀態(tài)良好,貼壁生長,無變圓、縮小或脫落等病理跡象,經(jīng)過熒光倒置顯微鏡、RT-PCR以及Western b

12、lot觀察發(fā)現(xiàn)Ad-Id1的轉染效率在第24小時約60％,48-72小時達高峰,約80％。Si-RNA-Id1轉染后4天,Id1在EPCs的表達被顯著抑制,轉染率約50％。
　　 3.2.4 Ad-Id1對EPCs增殖的作用
　　 采用MTT法分析發(fā)現(xiàn),Ad-Id1對EPCs增殖顯著影響。無論與未轉染對照組還是Ad-GFP對照組比較,Ad-Id1對EPCs的增殖有統(tǒng)計學差異(均*P＜0.05),提示Ad-Id1對EPCs

13、有促進增殖的作用。
　　 3.2.5 Ad-Id1對EPCs遷移的作用
　　 外源性Id1過表達顯著促進EPCs遷移。在Ad-Id1作用誘導下,平均每個視野中遷移EPCs的數(shù)目從7.1±1.8增加到26.1±2.8,增加了近3倍(*P＜0.01)。加入Id1封閉性抗體Id1-Ab后,Ad-Id1促遷移作用明顯減弱(＃P＜0.05),提示EPCs遷移能力的增強是過表達Id1導致。
　　 3.2.6利用小片段RNA(

14、si-RNA)干擾沉默Ad-Id1對EPCs增殖、遷移的影響
　　 結果表明si-RNA-Id1介導的Id1基因的沉默明顯抑制了EPCs的增殖、遷移功能,與未干預組及陰性對照組比較均有顯著差異(*p＜0.05)。
　　 3.3 Id1在血管損傷修復中的表達及作用
　　 3.3.1小鼠頸動脈損傷模型的建立
　　 經(jīng)損傷血管組織切片H&E染色證實,本研究成功復制了小鼠頸動脈損傷模型,鏡下觀察到血管損傷后7天局

15、部內膜有增生,14天時新生內膜增生明顯,到28天新生的內膜幾乎堵塞整個血管腔。內膜/中膜比值(IA/MA)14d組為1.30±0.15,28d組為4.10±0.20較損傷7d組的0.28±0.02顯著增加(分別為P＜0.01,P=0.000)。
　　 3.3.2 Id1在血管損傷局部血管壁的表達
　　 免疫組化實驗顯示Id1在損傷血管的新生內膜、中膜以及外膜組織均有表達。Id1mRNA在正常血管組織低表達,血管損傷后表達

16、迅速上升,114d即達到高峰,之后逐漸下降維持到血管損傷后第28天仍較對照組高。Western blot檢測到Id1蛋白表達在血管損傷后第7d開始上調,14d時達到高峰,然后逐漸回落,在損傷后第28天仍有表達。
　　 3.3.3移植過表達Id1的EPCs對損傷血管再內皮化的影響
　　 損傷14d時Ad-Id1-EPCs轉染組再內皮化率為68.36±4.51％,而Ad-GFP-EPCs轉染組及未轉染組再內皮化率分別為43.

17、1±6.59％、40.5±7.82％,兩者之間無統(tǒng)計學差異,但與Ad-Id1-EPCs轉染組比較均存在明顯差異(P＜0.05),說明轉染Id1過表達的EPCs可促進第14d時損傷血管再內皮化。
　　 3.3.4移植過表達Id1的EPCs對損傷血管局部新生內膜增殖的影響
　　 血管損傷后第14d,Ad-Id1-EPCs轉染組小鼠損傷頸動脈內、中膜比值為1.08±0.15,結果與Ad-GFP-EPCs組(1.16±0.14)

18、及未轉染組(1.15±0.17)比較三組之間比較無明顯差異(P＞0.05),而三組中膜面積均無明顯差異(P＞0.05),提示轉移植表達Id1的EPCs未減輕血管損傷后新生內膜的增殖程度。
　　 4.結論:
　　 4.1 Id1在靜止狀態(tài)的脾源性EPCs呈低表達,定位于細胞漿內;
　　 4.2 Id1影響EPCs增殖、遷移功能:過表達Id1可促進EPCs的增殖、遷移,干擾Id1則抑制EPCs的增殖、遷移;