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文檔簡介
1、目的:肺癌是全世界目前面臨的最嚴重公共健康問題之一,MEIS2是HOX基因的輔因子,在胚胎發(fā)育過程中起著重要的作用,本課題研究目的為探討RNA干擾技術沉默MEIS2基因對A549細胞凋亡和周期的影響、通過基因芯片分析技術探討MEIS2在非小細胞肺癌中的調控機制,及MEIS2與化療敏感性的相關性。
方法:
?。?)將構建成功的4條pLKO.1-MEIS2-MEIS2-shRNA慢病毒載體重組質粒瞬時轉染239FT細胞,收
2、集病毒液感染A549細胞(肺腺癌細胞),顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。運用RT-PCR、western blotting檢測MEIS2基因 mRNA及蛋白的表達水平,流式細胞儀檢測A549細胞凋亡及細胞周期變化。
?。?)基因芯片及生物信息學分析基因差異表達及信號通路的變化, RT-PCR、western blotting檢測BRCA1基因mRNA及蛋白的表達水平。
?。?)收集宜昌市第一人民醫(yī)院2012年2月至2016年1月住
3、院手術切除并經病理確診NSCLC(非小細胞肺癌)的石蠟包埋組織標本61例,收集整理標本對應患者的臨床資料,隨訪患者生存情況。應用免疫組化染色法檢測組織中MEIS2及BRCA1的表達,分析兩者表達的相關性,并將MEIS2、BRCA1表達納入生存分析,研究兩者與NSCLC術后輔助化療療效之間的關系。
結果:
?。?)本研究發(fā)現(xiàn)有2條pLKO.1-MEIS2-shRNA重組質粒能有效沉默MEIS2的表達。RT-PCR結果提示
4、MEIS2 mRNA表達降低,western blotting結果提示MEIS2蛋白表達也降低,光鏡顯示A549細胞皺縮、密度稀疏、部分死亡;流式細胞術提示細胞凋亡,細胞周期G2/M期比例增高。
?。?)基因芯片檢測DAVID分析發(fā)現(xiàn)DNA復制及細胞周期信號通路基因表達下調,BRCA1表達下調排第一位。RT-PCR結果提示BRCA1 mRNA水平降低,Western blot結果提示BRCA1蛋白表達也降低。
(3)6
5、1例NSCLC患者中,MEIS2和BRCA1的高表達率分別為57.38%(35/61)和65.57%(40/61),兩者表達呈正相關。NSCLC患者接受基于鉑類藥物化療4~6周期化療療效;20例CR+PR(32.8%),41例SD+PD(67.2%),MEIS2低表達患者有效率為21.3%(13/61),而MEIS2高表達有效率為11.5%(7/61),有極顯著性差異;BRCA1低表達患者有效率為23.0%(14/61),而BRCA1高
6、表達有效率為9.8%(6/61),有極顯著性差異。
結論:shRNA干擾技術可介導A549細胞的MEIS2沉默,MEIS2 mRNA和蛋白水平降低,出現(xiàn)細胞凋亡,G2/M期比例增高?;蛐酒夹g分析提示BRCA1表達下調排第一位,A549細胞BRCA1 mRNA和蛋白水平相應降低。BRCA1相關分子通路可能是MEIS2的重要下游靶通路,提示MEIS2通過BRCA1基因調控非小細胞肺癌細胞生長及細胞周期阻滯;免疫組化顯示MEIS
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