MicroRNA-30a-5p影響肺癌細胞增殖及遷移的研究.pdf

1、背景:肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率及致死率最高的癌癥，其中80％屬于非小細胞肺癌。盡管肺癌的臨床研究取得了較大的進展，早期的診斷技術不斷改進，手術、放化療及生物治療等治療技術不斷進步，但是非小細胞癌的5年生存率仍然很低。僅依靠臨床研究來提高肺癌患者的生存率及降低復發(fā)率是不夠的，加強病因發(fā)病學（特別是相關基因）的研究并開發(fā)診斷和治療肺癌的新靶點成為當前迫切的問題，而miRNA的發(fā)現(xiàn)及深入研究提供了這種可能。微小RNA（MicroRNAs）是一類

2、長約22個堿基的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA。miRNA可與靶基因mRNA的3'非編譯區(qū)(3'UTR)中的位點互補結合通過降解mRNA或抑制mRNA翻譯兩種方式調(diào)節(jié)靶基因的表達，進而影響生命活動。它的表達及功能失調(diào)常常會引起多種重要過程的紊亂，包括細胞分化、細胞增殖、細胞凋亡等。在腫瘤的發(fā)生過程中，不同的miRNA可能起著類似抑癌基因或者癌基因的作用。miR-30a-5p作為miRNA中的一種，近年有報道其在與多種腫瘤密切相關。然而，miR-

3、30a-5p在肺癌中的所發(fā)揮的作用尚不清楚。
　　目的:探討miR-30a-5p在肺癌中的差異性表達及臨床意義，進一步研究miR-30a-5p影響肺癌細胞增殖及遷移的可能機制，為明確肺癌發(fā)病機制提供重要的理論依據(jù)，并也有助于為肺癌診斷和治療尋找可能的的潛在靶標。
　　方法:通過實時定量PCR技術，分別檢測miR-30a-5p在臨床患者的術后肺癌組織及相應的無瘤正常組織中、多種肺癌細胞株及人正常胚肺細胞株的表達量進行檢測。就m

4、iR-30a-5p的肺癌組織中的表達水平與患者多種臨床病理因素（年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度、腫瘤TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移）及臨床預后分別進行統(tǒng)計學的相關性分析。利用生物信息學軟件（MiRanda、RNAhybrid和Findtar3軟件）預測miR-30a-5p可能作用的靶基因。利用雙熒光素酶報告基因分析實驗對靶基因進行驗證。通過實時定量PCR和免疫印跡等實驗進一步考察，miR-30a-5p在mRNA水平和蛋白水平上對靶基因的調(diào)控作

5、用。通過細胞增殖、細胞平板克隆形成、細胞周期、細胞凋亡、細胞劃痕及Transwell遷移實驗研究轉(zhuǎn)染miR-30a-5p對肺癌細胞增殖及遷移等生物學特性的影響。構建穩(wěn)定過表達miR-30a-5p的肺癌細胞株A549-miR-30a-5p并用其進行裸鼠移植瘤成瘤實驗，觀察荷瘤小鼠移植瘤生長情況;進行免疫組化實驗檢測移植瘤中細胞核增殖、細胞凋亡及其所調(diào)控的基因的蛋白表達情況。
　　結果:在臨床肺癌標本及多種肺癌細胞株中，miR-30a

6、-5p均呈現(xiàn)低表達。miR-30a-5p在已發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺癌組織樣本中的表達量更低。miR-30a-5p的低表達與腫瘤TNM分期及是否轉(zhuǎn)移呈正相關(P＜0.05)，而與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度均無相關性(P＞0.05); miR-30a-5p的低表達與不良預后呈正相關(P＜0.05)。乳酸脫氫酶A（以下簡稱LDHA）是miR-30a-5p作用的靶基因。miR-30a-5p可直接結合于LDHA mRNA的3'UTR并抑制熒光素酶的

7、活性。在A549和H460細胞株中，過表達miR-30a-5p可抑制LDHA蛋白的表達量，并不改變LDHA mRNA的表達量。轉(zhuǎn)染miR-30a-5p模擬物或siR-LDHA小干擾RNA均可抑制肺癌A549和H460細胞的體外增殖、遷移;轉(zhuǎn)染miR-30a-5p或siR-LDHA可引起肺癌A549和H460細胞的細胞周期阻滯于G0/G1期，但兩者均不會引起A549和H460肺癌細胞的凋亡。成功構建了穩(wěn)定過表達miR-30a-5p的A54

8、9-miR-30a-5p肺癌細胞株;裸鼠體內(nèi)移植瘤成瘤實驗的。結果提示，過表達miR-30a-5p可抑制肺癌A549細胞在裸鼠體內(nèi)的移植瘤生長。移植瘤免疫組化實驗結果表明，過表達miR-30a-5p可抑制肺癌細胞移植瘤中PCNA和LDHA蛋白的表達;過表達miR-30a-5p不能促進移植瘤細胞在體內(nèi)的凋亡。
　　結論:miR-30a-5p在臨床肺癌腫瘤組織及肺癌細胞中均低表達;miR-30a-5p的低表達與肺癌TNM分期，有無轉(zhuǎn)移