MicroRNA-30a-5p影響肺癌細(xì)胞增殖及遷移的研究.pdf

1、背景:肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率及致死率最高的癌癥，其中80％屬于非小細(xì)胞肺癌。盡管肺癌的臨床研究取得了較大的進(jìn)展，早期的診斷技術(shù)不斷改進(jìn)，手術(shù)、放化療及生物治療等治療技術(shù)不斷進(jìn)步，但是非小細(xì)胞癌的5年生存率仍然很低。僅依靠臨床研究來(lái)提高肺癌患者的生存率及降低復(fù)發(fā)率是不夠的，加強(qiáng)病因發(fā)病學(xué)（特別是相關(guān)基因）的研究并開(kāi)發(fā)診斷和治療肺癌的新靶點(diǎn)成為當(dāng)前迫切的問(wèn)題，而miRNA的發(fā)現(xiàn)及深入研究提供了這種可能。微小RNA（MicroRNAs）是一類

2、長(zhǎng)約22個(gè)堿基的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA。miRNA可與靶基因mRNA的3'非編譯區(qū)(3'UTR)中的位點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合通過(guò)降解mRNA或抑制mRNA翻譯兩種方式調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響生命活動(dòng)。它的表達(dá)及功能失調(diào)常常會(huì)引起多種重要過(guò)程的紊亂，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等。在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，不同的miRNA可能起著類似抑癌基因或者癌基因的作用。miR-30a-5p作為miRNA中的一種，近年有報(bào)道其在與多種腫瘤密切相關(guān)。然而，miR-

3、30a-5p在肺癌中的所發(fā)揮的作用尚不清楚。
　　目的:探討miR-30a-5p在肺癌中的差異性表達(dá)及臨床意義，進(jìn)一步研究miR-30a-5p影響肺癌細(xì)胞增殖及遷移的可能機(jī)制，為明確肺癌發(fā)病機(jī)制提供重要的理論依據(jù)，并也有助于為肺癌診斷和治療尋找可能的的潛在靶標(biāo)。
　　方法:通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，分別檢測(cè)miR-30a-5p在臨床患者的術(shù)后肺癌組織及相應(yīng)的無(wú)瘤正常組織中、多種肺癌細(xì)胞株及人正常胚肺細(xì)胞株的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。就m

4、iR-30a-5p的肺癌組織中的表達(dá)水平與患者多種臨床病理因素（年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度、腫瘤TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移）及臨床預(yù)后分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的相關(guān)性分析。利用生物信息學(xué)軟件（MiRanda、RNAhybrid和Findtar3軟件）預(yù)測(cè)miR-30a-5p可能作用的靶基因。利用雙熒光素酶報(bào)告基因分析實(shí)驗(yàn)對(duì)靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察，miR-30a-5p在mRNA水平和蛋白水平上對(duì)靶基因的調(diào)控作

5、用。通過(guò)細(xì)胞增殖、細(xì)胞平板克隆形成、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞劃痕及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)染miR-30a-5p對(duì)肺癌細(xì)胞增殖及遷移等生物學(xué)特性的影響。構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-30a-5p的肺癌細(xì)胞株A549-miR-30a-5p并用其進(jìn)行裸鼠移植瘤成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察荷瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)情況;進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)移植瘤中細(xì)胞核增殖、細(xì)胞凋亡及其所調(diào)控的基因的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:在臨床肺癌標(biāo)本及多種肺癌細(xì)胞株中，miR-30a

6、-5p均呈現(xiàn)低表達(dá)。miR-30a-5p在已發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺癌組織樣本中的表達(dá)量更低。miR-30a-5p的低表達(dá)與腫瘤TNM分期及是否轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P＜0.05)，而與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度均無(wú)相關(guān)性(P＞0.05); miR-30a-5p的低表達(dá)與不良預(yù)后呈正相關(guān)(P＜0.05)。乳酸脫氫酶A（以下簡(jiǎn)稱LDHA）是miR-30a-5p作用的靶基因。miR-30a-5p可直接結(jié)合于LDHA mRNA的3'UTR并抑制熒光素酶的

7、活性。在A549和H460細(xì)胞株中，過(guò)表達(dá)miR-30a-5p可抑制LDHA蛋白的表達(dá)量，并不改變LDHA mRNA的表達(dá)量。轉(zhuǎn)染miR-30a-5p模擬物或siR-LDHA小干擾RNA均可抑制肺癌A549和H460細(xì)胞的體外增殖、遷移;轉(zhuǎn)染miR-30a-5p或siR-LDHA可引起肺癌A549和H460細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，但兩者均不會(huì)引起A549和H460肺癌細(xì)胞的凋亡。成功構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-30a-5p的A54

8、9-miR-30a-5p肺癌細(xì)胞株;裸鼠體內(nèi)移植瘤成瘤實(shí)驗(yàn)的。結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)miR-30a-5p可抑制肺癌A549細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的移植瘤生長(zhǎng)。移植瘤免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-30a-5p可抑制肺癌細(xì)胞移植瘤中PCNA和LDHA蛋白的表達(dá);過(guò)表達(dá)miR-30a-5p不能促進(jìn)移植瘤細(xì)胞在體內(nèi)的凋亡。
　　結(jié)論:miR-30a-5p在臨床肺癌腫瘤組織及肺癌細(xì)胞中均低表達(dá);miR-30a-5p的低表達(dá)與肺癌TNM分期，有無(wú)轉(zhuǎn)移