miR--204--5p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用及機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的：結(jié)直腸癌(Colorectal cacner，CRC)給人類(lèi)造成了嚴(yán)重的身心危害，帶來(lái)不容忽視的健康和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。在美國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率及致死率均位居惡性腫瘤的第3位，隨著民眾健康意識(shí)的增強(qiáng)、診療技術(shù)及篩查手段的進(jìn)步，其發(fā)病率與死亡率均有所下降[1]。但中國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率及致死率常年位居惡性腫瘤的前5位，且發(fā)病年齡日趨年輕化，發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[2-3]。中國(guó)城市癌癥篩查計(jì)劃項(xiàng)目組開(kāi)展了城市地區(qū)常見(jiàn)癌癥（肺癌、乳腺

2、癌、大腸癌、食管癌、肝癌、胃癌）的綜合經(jīng)濟(jì)評(píng)價(jià)。通過(guò)多中心橫斷面調(diào)查(Multicenter Cross-sectional Survey)，統(tǒng)計(jì)分析了2012年至2014年在全國(guó)13個(gè)省市的37家三級(jí)醫(yī)院常見(jiàn)癌癥患者的醫(yī)療費(fèi)用及其相關(guān)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，結(jié)果顯示大腸癌患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)最重，人均支出約為6.9萬(wàn)元，并且晚期結(jié)直腸癌患者的治療費(fèi)用顯著高于早期患者[4]。盡管目前有多種方法診治結(jié)直腸癌，但因其早期癥狀不明顯，患者就診時(shí)間較晚，預(yù)后也較差

3、[5]。因此，對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)分子的識(shí)別及其功能特點(diǎn)的研究不僅能為早期診斷結(jié)直腸癌提供依據(jù)，也能為其治療提供新的靶點(diǎn)與思路。Masuda等[6]報(bào)道指出microRNA（miRNA）在結(jié)直腸癌中異常表達(dá)，并與腫瘤的分化程度、臨床分期、治療反應(yīng)及預(yù)后有關(guān)，提示miRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)，可作為早期診斷結(jié)直腸癌及反映病人預(yù)后的指標(biāo)。miR-204-5p在多種惡性腫瘤組織中低表達(dá)，并能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及上皮間質(zhì)

4、轉(zhuǎn)化(Epithelia-Mesenchymal Transition，EMT)[7-10]，但其在結(jié)直腸癌的相關(guān)報(bào)道較少。本課題前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-204-5p能阻滯HT29細(xì)胞的細(xì)胞周期于G1期，從而抑制HT29細(xì)胞的增殖能力[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察miR-204-5p在結(jié)直腸癌與正常腸黏膜組織中的表達(dá)差異及其對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及EMT的影響，探討其發(fā)揮作用的可能機(jī)制，旨在為早期診治結(jié)直腸癌提供新的依據(jù)及靶點(diǎn)。
　　方法：

5、(1)收集本院23例配對(duì)新鮮結(jié)直腸癌組織及配對(duì)正常腸黏膜組織，熒光定量PCR檢測(cè)其中miR-204-5p的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。(2)過(guò)表達(dá)miR-204-5p慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29及LoVo，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-204-5p的表達(dá)情況。(3)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)(Clone Formation Experiment)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)(Scratch Healing Exper

6、iment)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell Invasion Assay)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-204-5p在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)HT29、LoVo細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。(4)Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-204-5p后HT29和LoVo細(xì)胞中EMT相關(guān)分子E-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)情況。(5)利用TargetScan、miRDB及miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索miR-204-5p的靶基因

7、，在三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中得分均排名前50位的基因中取交集，預(yù)測(cè)得到的靶基因具有較高的可信度和準(zhǔn)確性。Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-204-5p后HT29和LoVo細(xì)胞中靶基因的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：(1)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與配對(duì)正常腸黏膜組織相比，miR-204-5p在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)（t=9.245，P＜0.001）。臨床病理分析結(jié)果顯示，miR-204-5p的表達(dá)水平與腫瘤大小(x2=7.078，P=0.

8、008)、TNM分期（x2=9.603，P=0.002）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(x2=7.340，P=0.007），而與患者年齡（x2=2.718，P=0.099）、性別（x2=2.718，P=0.099）、腫瘤分化程度(x2=1.343，P=0.511)、腫瘤部位（x2=0.434，P=0.510）及血清CEA水平（x2=0.910，P=0.340）無(wú)明顯相關(guān)性。(2)設(shè)置實(shí)驗(yàn)分組，將商品化過(guò)表達(dá)miR-204-5p的慢病毒轉(zhuǎn)染至HT29和

9、LoVo細(xì)胞設(shè)立為實(shí)驗(yàn)組即HT29-204-5P組和LoVo-204-5p組，將空載慢病毒轉(zhuǎn)染至HT29和LoVo細(xì)胞設(shè)立為對(duì)照組即HT29-NC組和LoVo-NC組。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)HT29-204-5P組、LoVo-204-5p組、HT29-NC組和LoVo-NC組細(xì)胞均有綠色熒光表達(dá)。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HT29-204-5P組細(xì)胞中miR-204-5p表達(dá)水平高于HT29-NC組（t=-20.488，P＜0.001），

10、LoVo-204-5p組細(xì)胞中miR-204-5p表達(dá)水平高于LoVo-NC組（t=-59.078，P＜0.001）。(3)平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組、HT29-NC組及LoVo-NC組克隆形成率分別為（11±2.25）％、（14.67±3.33）％、（18.33±2.75）％及（27.67±2.93）％，HT29-204-5p組細(xì)胞克隆形成率顯著低于HT29-NC組（t=20.172，P＜

11、0.001），LoVo-204-5p組細(xì)胞克隆形成率顯著低于LoVo-NC組（t=5.077，P=0.001）。(4)細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劃痕24h后HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組、HT29-NC組和LoVo-NC組劃痕愈合率分別為（16.03±2.35）％、（15.30±0.99）％、（25.41±4.36）％及（37.79±4.70）％，HT29-204-5p組劃痕愈合率顯著低于HT29-NC組（t=3.2

12、80，P=0.031），LoVo-204-5p組劃痕愈合率顯著低于LoVo-NC組（t=8.106，P=0.0012）。(5)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組、HT29-NC組和LoVo-NC組細(xì)胞透過(guò)數(shù)分別為（15.07±3.23）個(gè)、（51.47±4.35）個(gè)、(28.93±4.02)個(gè)及（112.9±7.73）個(gè)，HT29-204-5p組細(xì)胞透過(guò)數(shù)目顯著少于HT29-NC組(t

13、=4.85，P=0.008)，LoVo-204-5p組細(xì)胞透過(guò)數(shù)目顯著少于LoVo-NC組（t=12.003，P＜0.001）。(6)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-204-5p的HT29和LoVo細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)上調(diào)(P＜0.001;P=0.016)，Vimentin表達(dá)下調(diào)(P=0.002;P=0.013)。(7)在TargetScan、miRDB及miRTarBase三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索后初步得出MA