microRNA-29a在肝癌患者中的表達(dá)及對肝癌細(xì)胞增殖、遷移能力的研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種原發(fā)于肝臟的惡性腫瘤，是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤最常見死亡原因中位居第四位。慢性乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒感染，暴露于黃曲霉毒素和其他危險因素有助于HCC的發(fā)展。HCC具有起病隱匿，早期不易診斷，惡性程度高，預(yù)后差，進(jìn)展快等特點，僅10-20％的HCC患者適合外科治療，因此為HCC的診斷、預(yù)后和治療尋找一種新的有效的標(biāo)志物顯得十分重要。
　　

2、microRNAs(miRNAs)是一類小的、進(jìn)化高度保守的、內(nèi)源性的、單鏈的、非編碼的RNA分子，長度大約為21-24個核苷酸，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)。它們在許多重要的生物學(xué)進(jìn)程包括細(xì)胞周期、分化、發(fā)育和新陳代謝方面發(fā)揮了重要的作用。miRNAs既可以作為抑癌因子，又可以作為促癌因子發(fā)揮作用，它們的這種雙重作用促使很多研究人員在miRNAs和腫瘤方面進(jìn)行研究。越來越多的證據(jù)表明，一些特定的miRNAs在HCC中表達(dá)異常，并且與HCC的發(fā)

3、生、發(fā)展密切相關(guān)。近期研究表明有17個miRNAs在肝細(xì)胞癌中是高表達(dá)的，包括miR-181,miR-182,miR-183,miR-224,miR-21,miR-222,miR-96,miR-9,miR-216,miR-324-5p,miR-186,miR-155,miR-301,miR-221,miR-151,miR-374和miR-106b。另外，有9個miRNAs在肝細(xì)胞癌中低表達(dá)的，它們分別是:miR-139，miR-214，

4、miR-199a-3p,miR-199a-5p,miR-125a,miR-195,miR-34a,miR-200a,miR-122a。
　　microRNA-29a(miR-29a)，目前人類最感興趣的miRNAs家族的一員，研究證實，miR-29a在很多不同類型的腫瘤中如前列腺癌、腎細(xì)胞癌、胃癌和胰腺癌是不表達(dá)或者是表達(dá)下調(diào)的，然而miR-29a在HCC中的作用還不清楚?；谏鲜鲅芯浚覀兺茰y，miR-29a可能在HCC的發(fā)生發(fā)

5、展中起到一定作用。為此我們利用Realtime PCR對肝癌細(xì)胞系和臨床HCC患者標(biāo)本miR-29a的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。結(jié)果提示，miR-29a在肝癌細(xì)胞系和HCC患者標(biāo)本中的表達(dá)均呈下降趨勢，表明miR-29a在HCC的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。
　　本次實驗研究首先在人的不同肝癌細(xì)胞系、HCC患者和相應(yīng)癌旁組織檢測miR-29a的表達(dá)，研究miR-29a的表達(dá)水平與HCC患者生存時間的關(guān)系;利用體內(nèi)外實驗，分別檢測了miR-2

6、9a對肝癌細(xì)胞HepG2增殖及遷移能力的影響;利用Realtime PCR和Western Blot方法對預(yù)測的靶基因胰島素樣生長因子1受體進(jìn)行初步鑒定。內(nèi)容主要分為三個部分。
　　第一部分 miR-29a在人肝癌細(xì)胞系及肝癌患者標(biāo)本中的表達(dá)及其與HCC的預(yù)后
　　我們首先利用Realtime PCR分別檢測了人的不同的肝癌細(xì)胞系及62例臨床HCC患者標(biāo)本中miR-29a的表達(dá)水平，同時對miR-29a表達(dá)水平與肝癌患者生存

7、時間進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與正常肝細(xì)胞chang liver、LO2相比，miR-29a在肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7、MHCC7721和Hep3B中表達(dá)下調(diào)。62例肝癌患者癌腫組織標(biāo)本miR-29a的表達(dá)水平與對應(yīng)的癌旁組織相比下調(diào)，miR-29a表達(dá)水平與肝癌患者生存時間長短密切相關(guān)。表明miR-29a參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程。
　　第二部分 miR-29a在肝癌細(xì)胞HepG2中的生物學(xué)功能
　　了解miRNAs的生物學(xué)功

8、能為研究HCC主要腫瘤相關(guān)機(jī)制提供新手段，因此為明確miR-29a在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，我們在體外用miR-29a模擬物(mimic)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，通過CCK8實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、劃痕實驗、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell遷移實驗和裸鼠成瘤等檢測其對HepG2細(xì)胞功能影響。
　　實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCK8實驗、軟瓊脂克隆形成實驗與對照組相比，HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29a mimics后，其增殖的能力明顯減低;流式細(xì)胞

9、儀檢測發(fā)現(xiàn)，miR-29a對HepG2細(xì)胞凋亡無影響，它可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞周期的G1期阻滯;劃痕實驗及Transwell遷移實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-29a能抑制HepG2細(xì)胞的遷移;轉(zhuǎn)染miR-29a mimics的HepG2細(xì)胞種植在BALB/c裸鼠皮下，結(jié)果與對照組相比，成瘤能力明顯受到抑制。
　　本部分結(jié)果表明miR-29a能抑制HepG2細(xì)胞的增殖，不是通過誘導(dǎo)其凋亡實現(xiàn)的，而是通過引起HepG2細(xì)胞在細(xì)胞周期G1期發(fā)生阻

10、滯，同時miR-29a能抑制HepG2細(xì)胞遷移，提示miR-29a可能對肝癌的發(fā)生及發(fā)展起到重要作用。
　　第三部分 miR-29a靶基因預(yù)測及初步鑒定
　　前兩部分結(jié)果表明miR-29a參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程，為了進(jìn)一步研究miR-29a抑制HepG2細(xì)胞增殖及遷移的機(jī)制，我們對其靶基因進(jìn)行了初步鑒定。我們利用生物信息學(xué)的方法對miR-29a的靶基因進(jìn)行了初步預(yù)測，選擇出miR-29a功能相關(guān)的可能靶基因。初步明確胰島素

11、樣生長因子1受體(insulin-likegrowth factor1 receptor, IGF1R)為miR-29a的靶基因。通過免疫組化及westernBlot初步驗證了miR-29a能作用于IGF1R抑制其表達(dá)。同時我們還利用了siRNA技術(shù)證明抑制IGF1R的表達(dá)，可明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖及遷移能力。結(jié)果表明，IGF1R是miR-29a的靶基因，miR-29a可能是通過調(diào)節(jié)IGF1R的表達(dá)發(fā)揮其抑制HepG2細(xì)胞的增殖及